骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程血管管道的研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 目的 探索和建立人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)的技術(shù)方法，鑒定其生物學(xué)特性，為進(jìn)一步建立組織工程血管做準(zhǔn)備。 方法 人骨髓標(biāo)本來(lái)源于30歲左右男性健康志愿者。按骨髓穿刺的常規(guī)方法，抽取胸骨骨髓液5ml，肝素抗凝。DMEM培養(yǎng)液稀釋后，用人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法，分離出單個(gè)核細(xì)胞。用DMEM洗滌，加入DMEM培養(yǎng)液，并加入10﹪胎牛血清(FCS)。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活

2、力。24小時(shí)后，吸取培養(yǎng)液，連同未貼壁細(xì)胞棄去。貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換半量的培養(yǎng)液，12天后細(xì)胞融合時(shí)，用0.25﹪胰蛋白酶/0.02﹪EDTA消化液消化后，細(xì)胞傳代，倒置顯微鏡每天觀察生長(zhǎng)情況。繪制(P1、P5、P10)生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算原代和前兩代傳代干細(xì)胞的貼壁率。對(duì)第三代細(xì)胞行CD34的流式細(xì)胞儀表型鑒定。 結(jié)果 分離出人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色證實(shí)95﹪以上為活細(xì)胞。經(jīng)過(guò)24小時(shí)的培養(yǎng)，原代細(xì)胞貼壁黏附

3、在培養(yǎng)瓶，換液棄未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，12天后細(xì)胞融合。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形，排列有明顯的方向性。計(jì)算原代和前兩代間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁率，貼壁率無(wú)明顯差異。消化傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)加速，約8-10天左右細(xì)胞即融合，可以消化傳代。培養(yǎng)到第四代時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)倍增穩(wěn)定。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后，存活率達(dá)95﹪以上，增殖能力強(qiáng)，和傳代細(xì)胞具有相似的生長(zhǎng)特性。對(duì)第1、5、10代細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，結(jié)果顯示細(xì)胞傳代培養(yǎng)1-2

4、天細(xì)胞變化不大，細(xì)胞處于潛伏期。第三天起呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，至第5天到高峰，之后為平臺(tái)期。細(xì)胞表面CD34表達(dá)陰性。結(jié)論本實(shí)通過(guò)分離培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞和研究其體外培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性，為組織工程學(xué)帶來(lái)新的細(xì)胞來(lái)源。 第二部分同種主動(dòng)脈脫細(xì)胞血管基質(zhì)的制備 目的 探討體外主動(dòng)脈脫細(xì)胞的方法，為組織工程血管體的構(gòu)建提供血管支架。 方法 取液氮保存的同種主動(dòng)脈管道。將標(biāo)本置于Tris低滲緩沖液(PH 8．0，0

5、．1﹪EDTA和抑肽酶10KIU/m;l)4℃下孵育14小時(shí)。用含0．1﹪SDS的Tris低滲緩沖液(PH8．0)37℃下再孵育24小時(shí)。轉(zhuǎn)入PBS溶液中清洗，37℃洗滌3次，每次20分鐘。用Tris等滲緩沖液(DNase200μg/ml，RNase200gμg/ml PH7．6)充分沖洗掉殘留細(xì)胞，完成脫細(xì)胞支架制備。并對(duì)脫細(xì)胞前后的管壁進(jìn)行光鏡及電鏡形態(tài)學(xué)觀察以及進(jìn)行理化性能測(cè)定。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，

6、兩樣本均數(shù)比較采用配對(duì)比較t檢驗(yàn)，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。 結(jié)果 人主動(dòng)脈血管壁經(jīng)SDS法去細(xì)胞后，經(jīng)光鏡和電鏡觀察，脫細(xì)胞后血管壁無(wú)細(xì)胞殘留，膠原纖維和彈性纖維保留完整，脫細(xì)胞前后熱皺縮溫度無(wú)明顯變化(P>0.05)；去細(xì)胞后管壁含水量顯著增加，差別有顯著性(P<0.05)，去細(xì)胞前后管壁厚度無(wú)顯著性(P>0.05)(如表1)。 結(jié)論 SDS和消化酶法聯(lián)合去細(xì)胞效果良好，脫細(xì)胞前后理化性能沒(méi)有明顯變

7、化，初步制造了同種主動(dòng)脈血管壁脫細(xì)胞基質(zhì)材料，為構(gòu)建同種血管管道提供了較合適的支架材料。 第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在血管支架上的種植 目的 研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脫細(xì)胞血管支架上種植的前景。 方法 提取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)密度梯度法分離、培養(yǎng)和傳代。用SDS和DNase，RNase方法聯(lián)合脫去動(dòng)脈壁的細(xì)胞，制成血管支架。將培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植在支架上。首先將支架用DMEM浸泡24小時(shí)，

8、用胎牛血清浸泡12小時(shí)，在支架上涂上一層粘連蛋白以增加支架的黏附性。然后再將培養(yǎng)的細(xì)胞按一定的濃度分兩次種植在支架上，培養(yǎng)7天。在光鏡和電鏡下觀察培養(yǎng)結(jié)果。 結(jié)果 標(biāo)本表面有一層連續(xù)的細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，連續(xù)性較好，但是未向血管基質(zhì)內(nèi)部生長(zhǎng)，作為種子細(xì)胞的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脫細(xì)胞基質(zhì)上具有鋪展和生長(zhǎng)能力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與脫細(xì)胞血管基質(zhì)支架居有良好的相容性，細(xì)胞在支架表面黏附緊密。 結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植