轉(zhuǎn)基因人骨髓間充質(zhì)干細胞作為組織工程韌帶種子細胞的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 嚴(yán)重創(chuàng)傷后的大段韌帶組織缺損一直是修復(fù)重建外科的難題，目前臨床上多采用韌帶移植來修復(fù)、重建損傷的韌帶組織，目前臨床使用移植材料較多。其中自體韌帶移植臨床使用廣泛，但由于供體部位功能缺損，手術(shù)時間較長，創(chuàng)傷大，及移植后韌帶的疤痕愈合等問題使其常無法達到滿意的臨床效果。組織工程韌帶(tissue-engineered ligament，TEL)是目前組織工程研究的熱點，作為韌帶組織理想的替代物，其具有以下優(yōu)點：(1)利

2、用支架和種子細胞在體外構(gòu)建，避免了再次取材給患者帶來的痛苦；(2)根據(jù)缺損情況進行塑形、構(gòu)建，對于大段的韌帶缺損優(yōu)點突出；(3)有效降低了免疫反應(yīng)及力學(xué)強度下降問題。
　　 TEL由種子細胞和具有韌帶性能的支架復(fù)合而成，種子細胞的選擇是TEL構(gòu)成的關(guān)鍵步驟。而其中采用堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)促進骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal

3、 stem cells，BMSCs)向肌腱細胞分化的研究是TEL種子細胞研究的熱門方向。BMSCs可以通過骨髓穿刺獲得，體外易于分離、純化、培養(yǎng)、擴增，短期內(nèi)即可獲得構(gòu)建TEL需要的細胞數(shù)量。動物研究表明bFGF是韌帶愈合過程中重要的生長因子，其可促進韌帶的愈合并能誘導(dǎo)BMSCs向韌帶細胞方向分化。局部應(yīng)用重組細胞因子和生長因子，代謝較快，價格較高，且局部免疫反應(yīng)大，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)能有效克服上述缺點。本研究嘗試?yán)孟俨《据d體將bFGF

4、及綠色熒光基因(enhanced green fluorescent protein，eGFP)轉(zhuǎn)入h-BMSCs，并評價bFGF的表達情況，及轉(zhuǎn)染后細胞的增殖、分化及產(chǎn)生韌帶特異性細胞外基質(zhì)的表達情況。
　　 方法：
　　 1.攜帶人bFGF基因和增強型綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒載體Ad.bFGF-eGFP的構(gòu)建。(病毒構(gòu)建由invitrogen公司構(gòu)建)；
　　 2.人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone

5、 marrow mesenchymal stemcells，h-BMSCs)的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定；
　　 (1)骨髓采集及h-BMSCs的分離、純化：采用髂前上棘穿刺獲取10ml骨髓/人，采用梯度離心法和貼壁法結(jié)合分離、培養(yǎng)、純化h-BMSCs。
　　 (2)h-BMSCs的鑒定：采用形態(tài)學(xué)觀察、流式細胞儀鑒定單克隆抗體，及三向誘導(dǎo)分化相結(jié)合進行h-BMSCs的鑒定。
　　 3.利用Ad.bFGF-eGFP在

6、體外轉(zhuǎn)染h-BMSCs，設(shè)正常h-BMSCs及轉(zhuǎn)染空病毒的h-BMSCs為對照組，觀察三組細胞的增殖情況及bFGF、韌帶特異性細胞外基因的表達和分泌的情況；
　　 (1)用Ad.bFGF-eGFP采用50的MOI值體外轉(zhuǎn)染h-BMSCs，通過綠色熒光測定轉(zhuǎn)染效率。三組細胞采用ELISA方法對細胞培養(yǎng)液中bFGF進行定量分析。
　　 (2)轉(zhuǎn)染后細胞增殖、多向誘導(dǎo)分化能力及產(chǎn)生韌帶特異性細胞外基質(zhì)的情況：細胞培養(yǎng)過程中每日

7、在相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及增殖情況，采用MTT法繪制生長曲線。用RT-PCR方法定量檢測h-BMSCs中Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、Ⅲ型膠原(CollagenⅢ)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)在基因水平的表達。Western-blot半定量檢測bFGF對h-BMSCs中CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin、α-SMA、Vimenti

8、n蛋白水平表達的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.原代培養(yǎng)的h-BMSCs貼壁后細胞開始增殖，細胞由圓形轉(zhuǎn)化為三角形、多角形和梭形，1周后，單克隆細胞集落開始出現(xiàn)，并呈指數(shù)增殖，10ml骨髓液分離得到的h-BMSCs在體外培養(yǎng)擴增3周可獲取2×107個細胞。
　　 2.分離的h-BMSCs不表達CD29、CD90,表達CD34和/或CD45，在不同的的培養(yǎng)基下，細胞具有出現(xiàn)三向分化潛能：成骨、成脂、成軟骨方向誘導(dǎo)分

9、化。
　　 3.攜帶bFGF基因的腺病毒對細胞有很高的轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)MOI值為50時，細胞轉(zhuǎn)染率高可達到95％以上。轉(zhuǎn)染后采用ELISA檢測轉(zhuǎn)染組bFGF表達量較轉(zhuǎn)染Ad.eGFP組及未轉(zhuǎn)染組有顯著差異。分泌的峰值出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后第2天，至第7d表達量仍有顯著性差異，此后表達逐漸下降，但仍保持在一個可檢測水平之上。
　　 4.Ad.bFGF-eGFP轉(zhuǎn)染組h-BMSCs表現(xiàn)為均勻一致的纖維母細胞樣細胞表型，呈梭形帶有長的細胞突

10、起，細胞密度明顯高于兩組對照組。Western-blot及RT-PCR方法檢測顯示轉(zhuǎn)染組CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin、α-SMA、Vimentin在蛋白水平及基因水平表達均顯著高于對照組。
　　 結(jié)論：
　　 1.h-BMSCs方便獲取，穿刺過程對機體創(chuàng)傷小。體外擴增能力強大，10ml骨髓在體外培養(yǎng)三周后即可獲取2×107個細胞，可以滿足構(gòu)建TEL所需細胞數(shù)量，是構(gòu)建TEL比較理想的種子