以人臍帶間充質(zhì)干細胞為種子細胞構建組織工程脂肪的實驗研究.pdf

1、目的：1.探討人臍帶間充質(zhì)干細胞(human Umhilical Cord Mesenchvmal Stem Cells hUCMSCs)的體外分離、純化及培養(yǎng)條件，并對其生物學特性進行研究；2.觀察hUCMSCs凍存復蘇后向脂肪細胞定向分化的能力；3.觀察蠶絲素多孔支架對hUCMSCs吸附作用及支架對hUCMSCs形態(tài)、功能及活性的影響，探討蠶絲素多孔支架與hUCMSCs構建組織工程脂肪的可行性。 方法：1.將剔除動靜脈的新鮮

2、人臍帶組織切成小塊培養(yǎng)，得到貼壁細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，細胞計數(shù)繪制細胞生長曲線；流式細胞儀測定細胞表面標記；化學染色及RT-PCR檢測其體外誘導成脂和成骨分化的能力；RT-PCR檢測干細胞特異性標志基因OCT-4；2.將第1代的hUCMSCs采用梯度冷凍技術凍存5個月，復蘇后培養(yǎng)至第12代時，加入成脂誘導劑培養(yǎng)。當誘導至21天時行油紅O染色，7天及14天時用RT-PCR技術分別檢測成脂轉化基因過氧化物酶增殖劑受體(PPARγ-2

3、)和脂蛋白酯酶(LPL)；3.將hUCMSCs制成細胞懸液接種于蠶絲素多孔支架，熒光倒置相差顯微鏡、掃描電鏡和四甲基偶氮唑藍(MTT)法觀察其在支架上的吸附和生長情況，將細胞-支架復合物成脂誘導6周后移植于大鼠體內(nèi)，觀察細胞在支架上成脂情況。 結果：1.體外培養(yǎng)4-6天后，有細胞從組織塊中游出；細胞傳代培養(yǎng)至第10代，無明顯的形態(tài)和增殖能力改變；細胞陽性表達CD13、CD44，而CD14、CD34、HLA-DR表達呈陰性。體外誘

4、導實驗證實，該細胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RT-PCR顯示其表達干細胞特異性因子OCT-4；2.hUCMSCs凍存復蘇后，活細胞約為86％，流式細胞儀分析這些細胞表達CD13、CD44和CD71等MSCs標志物，不表達CD14、CD34和HLA-DR表面抗原。復蘇細胞在成脂誘導劑的作用下，細胞中有脂滴產(chǎn)生，通過油紅O染色顯示細胞核周圍有脂滴聚集，通過RT-PCR檢測有LPL及PPARγ-2 mRNA的表達。3.細胞與支架復合培養(yǎng)1-

5、2天后可見hUCMSCs與蠶絲素多孔支架充分附著，培養(yǎng)5-7天細胞生長增殖十分活躍，10天左右時，蠶絲支架孔中hUCMSCs成片狀融合。熒光倒置相差顯微鏡和掃描電鏡見細胞與支架黏附良好并有大量基質(zhì)分泌，且活性指標與正常培養(yǎng)的hUCMSCs比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，細胞-支架復合物成脂誘導4周時，已有成脂樣細胞生成，并與蠶絲素蛋白多孔支架牢固粘附，成脂誘導6周，見大量成脂樣細胞生成；將成脂誘導6周的細胞-支架復合物植入大鼠體內(nèi)植入

6、4周后，可見有脂肪形成，8周后支架材料繼續(xù)降解，脂肪組織形成明顯，對照組支架材料逐漸降解，未見脂肪組織形成。 結論：1. hUCMSCs能在體外培養(yǎng)、擴增并且具有和骨髓間充質(zhì)干細胞相似的生物學特性；2.將hUCMSCs凍存復蘇后培養(yǎng)至第12代，仍具有向脂肪細胞分化的潛能，可作為脂肪組織工程的種子細胞來源；3.蠶絲素多孔支架對hUCMSCs具有良好的吸附作用，并能維持其正常形態(tài)、功能及活性，蠶絲素多孔支架是hUCMSCs三維立體培