人臍帶Wharton膠支架負(fù)載脂肪干細(xì)胞構(gòu)建新型組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探索人臍帶Wharton膠支架負(fù)載脂肪干細(xì)胞構(gòu)建新型組織工程軟骨的可行性，并評(píng)價(jià)該組織工程軟骨修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損的效果。
　　方法：
　　⑴從兔頸背部皮下脂肪分離得到脂肪干細(xì)胞，培養(yǎng)至P3代后通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)鑒定其表面標(biāo)記物，明確其干細(xì)胞來(lái)源。⑵普通培養(yǎng)至P3代后更換為誘導(dǎo)液（DMEM中加入10％FBS，10ng/ml TGF-β1，25ng/ml bFGF，10-7M地塞米松）成軟骨方向誘導(dǎo)兩周，收集

2、細(xì)胞并調(diào)整終濃度為1×107/ml，將細(xì)胞接種至Wharton膠支架上繼續(xù)三維誘導(dǎo)一周構(gòu)建組織工程軟骨。FDA-PI染色及Hoechst33258染色評(píng)估細(xì)胞在支架上的活力及增殖情況，掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上分布及黏附情況，甲苯胺藍(lán)、番紅O、Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。⑶于兔膝關(guān)節(jié)軟骨滑車(chē)處形成1個(gè)直徑4mm，深2mm的環(huán)形全層軟骨缺損，設(shè)置空白組、單純支架材料組及細(xì)胞支架復(fù)合體組。術(shù)后24周取材，缺損修復(fù)區(qū)行大體觀察、

3、組織學(xué)染色、糖胺多糖、總膠原含量檢測(cè)及生物力學(xué)測(cè)定分析評(píng)價(jià)缺損修復(fù)情況。
　　結(jié)果：
　　⑴流式細(xì)胞學(xué)鑒定顯示CD73、CD90、CD105陽(yáng)性，CD34、CD45、HLA-DR陰性，提示所取細(xì)胞為脂肪來(lái)源干細(xì)胞；⑵FDA-PI染色及Hoechst33258染色可見(jiàn)支架上粘附的細(xì)胞分布均勻，活細(xì)胞較多，死細(xì)胞較少，支架深層也有部分細(xì)胞粘附。掃描電鏡觀察可見(jiàn)誘導(dǎo)后大量細(xì)胞黏附于支架孔隙內(nèi)，呈圓形或橢圓形。組織學(xué)染色陽(yáng)性提示誘導(dǎo)

4、后細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)；⑶術(shù)后24周細(xì)胞支架復(fù)合體組缺損區(qū)大部分被修復(fù)，缺損部位被軟骨組織填充，修復(fù)區(qū)表面光滑。組織學(xué)染色顯示有典型的透明軟骨樣結(jié)構(gòu)，GAG、總膠原定量測(cè)定提示可達(dá)正常值的90%以上，生物力學(xué)測(cè)定提示與正常軟骨相似。單純支架材料組雖然缺損區(qū)大部分被修復(fù)，但修復(fù)區(qū)多為纖維軟骨，僅有少量透明軟骨樣結(jié)構(gòu)?？瞻捉M未能修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，纖維組織部分填充缺損，表面覆蓋薄層纖維組織。
　　結(jié)論：
　　脂肪干細(xì)胞作為軟骨組