人脂肪來(lái)源干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化脂肪組織的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景及目的] 隨著修復(fù)重建外科的發(fā)展，自體組織移植及人工材料替代修復(fù)軟組織缺損成為重要的治療手段，盡管這能有效地改善受區(qū)的組織缺損狀況，但自體移植物的來(lái)源，血供及其供區(qū)的繼發(fā)畸形都限制了它的使用。此外，還有其它多種多樣的方法也被嘗試，包括自體真皮移植，自體脂肪細(xì)胞游離移植，膠原注射，人工材料填充等等。但這些方法的治療效果也不十分理想：例如人工材料的移植排斥反應(yīng)，游離脂肪移植后的吸收且吸收率難以預(yù)測(cè)等。盡管修復(fù)軟組織缺損的方法較

2、多，卻難以完全滿足臨床的需要。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為臨床上更好的解決組織缺損等難題提供了一個(gè)新的思路。 組織工程技術(shù)能以少量種子細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物材料復(fù)合，修復(fù)較大的組織或器官缺損，重建生理功能，為真正實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷修復(fù)組織缺損和真正意義上的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能重建開辟了新的途徑。組織工程學(xué)的發(fā)展需要幾個(gè)必備的因素，即：(1)可獲得的種子細(xì)胞，并能控制其生長(zhǎng)和組織形成；(2)結(jié)構(gòu)精確的三維支架，以適合再造需要的組織量和形狀，而且與細(xì)

3、胞具有良好的組織相容性；(3)適宜的微環(huán)境，能提供充分的血供和營(yíng)養(yǎng)，維持細(xì)胞增殖和組織功能。 目前已證實(shí)脂肪組織中存在類似骨髓基質(zhì)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞，且被命名為脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(ASCs)。這種干細(xì)胞經(jīng)證實(shí)同樣具有體內(nèi)外多向分化誘導(dǎo)潛力，如能向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及心肌細(xì)胞定向轉(zhuǎn)化，對(duì)多種組織的損傷具有良好的修復(fù)作用，而且取材方便，獲取量大，不易造成供區(qū)繼發(fā)畸形等，已作為組織工程研究中的重要種子細(xì)胞。

4、 組織工程常用的支架材料分為天然材料和人工合成材料，天然材料包括：天然多糖類材料有纖維素、甲殼素、透明質(zhì)酸等；天然蛋白質(zhì)類材料有膠原和纖維蛋白等；人工合成的材料有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或兩者聚合物聚乳酸一聚乙醇酸(PLGA)、聚四氟乙烯、羥基磷灰石、聚乙烯醇、海藻酸鹽等。依據(jù)他們各自特點(diǎn)，被不同程度地應(yīng)用于組織工程的研究。由于應(yīng)用脂肪細(xì)胞組織工程技術(shù)修復(fù)軟組織缺損近期才引起學(xué)者們的關(guān)注，故而用于構(gòu)建脂肪組織工程有效的生物

5、材料支架研究不多，主要為可降解的多孔泡沫，如PLGA、透明質(zhì)酸、膨體聚四氟乙烯等，然而，究竟何種材料能成為脂肪組織工程種子細(xì)胞的理想載體尚不十分明確，且關(guān)于脂肪組織工程的研究國(guó)內(nèi)報(bào)道甚少，對(duì)這一課題進(jìn)行廣泛深入的探討具有深遠(yuǎn)意義。 本實(shí)驗(yàn)研究了人AsCs向脂肪組織的體外定向誘導(dǎo)分化能力，同時(shí)判斷種子細(xì)胞ASCs與Ⅰ型固態(tài)膠原支架及纖維蛋白膠可注射支架復(fù)合后在體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織的可能性，以尋找適宜的脂肪組織工程種子細(xì)胞載體

6、，探索構(gòu)建組織工程化脂肪組織的有效方法；另外，對(duì)ASCs進(jìn)行DiI體外熒光標(biāo)記，觀察該標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞生物性狀的影響，為脂肪干細(xì)胞研究尋找理想的細(xì)胞標(biāo)記方法。 [材料與方法] 一、成人脂肪來(lái)源干細(xì)胞(ASCs)的分離培養(yǎng)及鑒定取人吸脂術(shù)抽吸物的脂質(zhì)部分，使用酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及功能變化，細(xì)胞傳至第3代后供實(shí)驗(yàn)用。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面部分與干細(xì)胞相關(guān)的分子如CD29、CD34、CD44，確定細(xì)胞類型；同時(shí)

7、對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外定向成脂、成骨誘導(dǎo)分化，并以油紅O染色及茜素紅染色進(jìn)行鑒定。 二、脂肪干細(xì)胞體外Dil熒光標(biāo)記及觀察標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞生物性狀的影響熒光染料DiI體外標(biāo)記ASCs，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及傳代后熒光強(qiáng)度的變化；檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記后成脂能力。使用xTT比色分析法檢測(cè)接種細(xì)胞增殖率，同時(shí)將培養(yǎng)細(xì)胞上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)含量測(cè)定，檢測(cè)熒光染料的細(xì)胞毒性。 三、以Ⅰ型膠原固態(tài)支架為載體材料構(gòu)建組織工程化

8、脂肪組織的實(shí)驗(yàn)研究 1．細(xì)胞一支架復(fù)合物體外生物相容性檢測(cè)將脂肪干細(xì)胞接種于支架材料形成復(fù)合物，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)行XTT比色分析檢測(cè)接種細(xì)胞增殖率；同時(shí)將培養(yǎng)細(xì)胞上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)含量測(cè)定，檢測(cè)材料的細(xì)胞毒性；Dil標(biāo)記前后細(xì)胞一支架粘附率檢測(cè)；最后掃描電鏡觀察DiI標(biāo)記前后細(xì)胞與載體的黏附性。 2．體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織將Ⅰ型膠原支架與DiI標(biāo)記的成脂誘導(dǎo)后ASCs混合體外培養(yǎng)三天，設(shè)空白支

9、架為對(duì)照組，同體雙側(cè)植入裸鼠背部皮下，12周后取出植入物。進(jìn)行組織工程新生物大體觀察和濕重測(cè)定后熒光顯微鏡觀察大體組織標(biāo)本，最后組織學(xué)檢測(cè)、油紅O染色定性。 四、以纖維蛋白膠可注射支架為載體材料構(gòu)建組織工程化脂肪組織的實(shí)驗(yàn)研究1．細(xì)胞一支架復(fù)合物體外生物相容性檢測(cè)纖維蛋白膠由A(纖維蛋白原)、B(凝血酶)兩液組成，將A液與脂肪干細(xì)胞混合，A、B兩液分開抽入雙聯(lián)注射器中，通過(guò)一混合管使兩液混合，體外形成細(xì)胞一凝膠復(fù)合物，顯微鏡下觀

10、察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)行XTT比色分析檢測(cè)接種細(xì)胞增殖率；同時(shí)將培養(yǎng)細(xì)胞上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)含量測(cè)定，檢測(cè)材料的細(xì)胞毒性；檢測(cè)DiI標(biāo)記前后細(xì)胞一支架粘附率；掃描電鏡觀察DiI標(biāo)記前后細(xì)胞與載體的黏附性。2．體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織將A液與標(biāo)記DiI的成脂誘導(dǎo)后ASCs混合制成細(xì)胞懸液，雙聯(lián)注射器將A、B兩液混合后同體雙側(cè)注入裸鼠背部皮下，設(shè)空白支架為對(duì)照組，12周后取出注入物。進(jìn)行組織工程新生物大體觀察和濕重測(cè)定后熒光顯微鏡觀

11、察大體組織標(biāo)本，最后組織學(xué)檢測(cè)、油紅O染色定性。 [結(jié)果] 1．原代培養(yǎng)的ASCs形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖及多向分化能力。在脂肪及成骨分化培養(yǎng)基的作用下，分化出成熟的脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞，油紅o、茜素紅染色陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到細(xì)胞表面抗原分子CD29、CD34、CD44持續(xù)表達(dá)，說(shuō)明其具有干細(xì)胞特性。 2．DiI標(biāo)記脂肪干細(xì)胞陽(yáng)性率為100％，該熒光染料不破壞細(xì)胞，不干擾細(xì)胞增殖，體外培養(yǎng)一周內(nèi)未見(jiàn)熒光減弱

12、，當(dāng)細(xì)胞傳至第三代后，熒光有所減弱，第六代細(xì)胞熒光明顯降低，熒光標(biāo)記陽(yáng)性率不到30％。 3．兩種支架均與ASCs有良好的相容性及黏附性，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，不影響細(xì)胞增殖；兩組實(shí)驗(yàn)組均在裸鼠皮下發(fā)現(xiàn)新生組織塊，膠原支架組新生物平均濕重為0.019g，纖維蛋白膠支架組新生物平均濕重為0.028g，常規(guī)病理切片及油紅O染色均證實(shí)其為成熟脂肪組織，熒光顯色陽(yáng)性證實(shí)其為外源性。兩組空白支架對(duì)照組未見(jiàn)脂肪組織形成。 [討論] 軟

13、組織缺損的修復(fù)重建是整形外科面臨的重大挑戰(zhàn)。針對(duì)小范圍軟組織缺損，臨床多采用游離脂肪移植技術(shù)。但游離移植的脂肪顆粒由于缺乏有效的血液供應(yīng)，僅僅只有40％-60％體積的能存活，而且這種存活率術(shù)前還難以估計(jì)。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為解決上述難題提供了一種革命性的思路。通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，我們就有可能獲得足夠體積的自體軟組織來(lái)源。成人的間充質(zhì)干細(xì)胞被證實(shí)能被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞系。在脂肪組織中也被證實(shí)包含這種具有多向分化潛力的細(xì)胞。脂肪組織類似于人

14、類骨髓，同樣來(lái)自于中胚層而且有研究已經(jīng)證實(shí)在脂肪基質(zhì)中包含有多能干細(xì)胞。這種干細(xì)胞被命名為脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞，縮寫為ASCs。 ASCs作為種子細(xì)胞與其他細(xì)胞相比具有相當(dāng)?shù)牡膬?yōu)越性，首先，ASCs容易獲得，對(duì)患者造成的痛苦小。對(duì)于肥胖者又需組織工程種子細(xì)胞進(jìn)行整形治療的患者尤其適合。其次，這種細(xì)胞在體外增殖速度快，傳代培養(yǎng)可獲得大量有分化能力的細(xì)胞。 在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，ASCs能在體外分化為成熟的脂肪細(xì)胞，而且脂肪分化誘導(dǎo)后

15、的ASCs(adipo．ASCs)與Ⅰ型膠原支架混合培養(yǎng)后能在裸鼠皮下新生結(jié)構(gòu)功能完整的脂肪組織塊。該研究提示，ASCs作為種子細(xì)胞的確可以應(yīng)用于脂肪組織的組織工程研究，并且能合成具有三維結(jié)構(gòu)及功能的脂肪組織。 特別值得一題的是，相對(duì)整形重建外科而言，術(shù)后瘢痕是需要重點(diǎn)考慮的因素。傳統(tǒng)的片狀或海綿狀支架材料都不可避免要在受區(qū)做切口方可植入，這不可避免會(huì)殘留瘢痕。在我們實(shí)驗(yàn)中，我們使用纖維蛋白膠可注射支架構(gòu)建組織工程化脂肪組織也獲