應(yīng)用去分化脂肪細(xì)胞構(gòu)建工程化脂肪組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的：
　　 隨著整復(fù)重建外科的發(fā)展,自體組織移植及人工材料替代修復(fù)軟組織缺損成為重要的治療手段,盡管這能有效地改善受區(qū)的組織缺損狀況,但自體移植物的來源十分有限,又常受到血供及其供區(qū)的繼發(fā)畸形的限制,游離脂肪移植的自體吸收率較高,人工材料易產(chǎn)生排斥反應(yīng)等,故目前這些方法的治療效果均不是十分理想,難以完全滿足臨床的需要。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為臨床上更好的解決組織缺損等難題提供了一個(gè)新的思路。
　　 近年來,組織工程技

2、術(shù)能以少量種子細(xì)胞,經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物材料復(fù)合,修復(fù)較大的組織或器官缺損,重建生理功能,為真正實(shí)現(xiàn)無損傷修復(fù)組織缺損和真正意義上的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能重建開辟了新的途徑。組織工程學(xué)的發(fā)展需要幾個(gè)必備的因素,即:(1)可獲得的種子細(xì)胞,并能控制其生長和組織形成；(2)結(jié)構(gòu)精確的三維支架,以適合再造需要的組織量和形狀,而且與細(xì)胞具有良好的組織相容性；(3)適宜的微環(huán)境,能提供充分的血供和營養(yǎng),維持細(xì)胞增殖和組織功能。
　　 近年來,人脂

3、肪組織來源的干細(xì)胞(Adipose derived stem cells,ASCs)成為當(dāng)今干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。但ASCs是位于人脂肪組織內(nèi)的一個(gè)混雜細(xì)胞群體。只有大約40％的細(xì)胞能向脂肪細(xì)胞分化。因此,ASCs并不能完全滿足脂肪組織工程的發(fā)展需要。故尋找一種分離容易、增殖能力強(qiáng)、成脂分化率高的更優(yōu)秀的種子細(xì)胞仍然是研究熱點(diǎn)。
　　 脂肪組織內(nèi)含有多種不同的細(xì)胞,主要有成熟脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、組織細(xì)胞和干細(xì)

4、胞等。大量的脂質(zhì)聚集使脂肪細(xì)胞具有的漂浮性,導(dǎo)致細(xì)胞難于體外培養(yǎng),因此對(duì)該細(xì)胞的特性研究很少。脂肪細(xì)胞由此被認(rèn)為是處于分化終末期,缺乏增殖能力的一種細(xì)胞。有研究表明,成熟脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中,能脫去脂滴,重新啟動(dòng)增殖機(jī)制,開始分裂增生。我們把這種生理轉(zhuǎn)變稱之為脂肪細(xì)胞去分化。
　　 脂肪細(xì)胞去分化將開創(chuàng)細(xì)胞生理學(xué)一個(gè)令人驚喜的領(lǐng)域,改變?nèi)藗儗?duì)于組織再生能力的許多觀點(diǎn)。然而,關(guān)于去分化脂肪細(xì)胞(dedi fferentiat

5、e adipocyte,DA)的細(xì)胞生物學(xué)特性研究還很少。前期研究證實(shí)DA在體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)下具有向成脂、成骨、成軟骨分化等多向分化能力,且較之ASCs有更高的成脂能力。因此,DA有可能成為脂肪組織工程更具前景的種子細(xì)胞來源。
　　 組織工程常用的支架材料分為天然材料和人工合成材料,天然材料包括:天然多糖類材料有纖維素、甲殼素、透明質(zhì)酸等；天然蛋白質(zhì)類材料有膠原和纖維蛋白等；人工合成的材料有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或

6、兩者聚合物聚乳酸一聚乙醇酸(PLGA)、聚四氟乙烯、羥基磷灰石、聚乙烯醇、海藻酸鹽等。依據(jù)他們各自特點(diǎn),被不同程度地應(yīng)用于組織工程的研究。由于應(yīng)用脂肪細(xì)胞組織工程技術(shù)修復(fù)軟組織缺損近期才引起學(xué)者們的關(guān)注,故而用于構(gòu)建脂肪組織工程有效的生物材料支架研究不多,目前常用的有可降解的多孔泡沫,如PLGA、透明質(zhì)酸、膨體聚四氟乙烯等,然而,究竟何種材料能成為脂肪組織工程種子細(xì)胞的理想載體尚不十分明確,如果能找出最適合構(gòu)建工程化脂肪的支架材料,將能

7、大大促進(jìn)脂肪組織工程的研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬研究人DA向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化中相關(guān)基因表達(dá),同時(shí)判斷種子細(xì)胞與Ⅰ型固態(tài)膠原支架及纖維蛋白膠可注射支架復(fù)合后在體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織的可能性,以尋找適宜的脂肪組織工程種子細(xì)胞載體,探索構(gòu)建組織工程化脂肪組織的有效方法；另外,對(duì)DA進(jìn)行AD.EGFP體外熒光標(biāo)記,觀察該標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞生物性狀的影響,為種子細(xì)胞研究尋找理想的細(xì)胞標(biāo)記方法。
　　 方法：
　　

8、 1、DA、ASCs的分離、培養(yǎng)及檢測
　　 自成人吸脂術(shù)后抽吸物提取成熟脂肪細(xì)胞及ASCs,天花板貼壁培養(yǎng)法誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞去分化,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,獲得DA。同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外定向成脂、成骨誘導(dǎo)分化,并以油紅0染色、茜素紅染色進(jìn)行鑒定。Real-time PCR分析細(xì)胞內(nèi)PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、Leptin、LPL、RLINX2、SOX9的表達(dá)水平。
　　 2.Ad.EGFP轉(zhuǎn)染并標(biāo)記DA
　

9、　 Ad.EGFP按不同感染復(fù)數(shù)(multiphcity of infection,MOI)值(MOI=0,10,20,30,50,100)體外轉(zhuǎn)染DA,進(jìn)行EGFP熒光標(biāo)記,倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況及傳代后熒光強(qiáng)度的變化；測定腺病毒轉(zhuǎn)染DA的效率；油紅0染色檢測細(xì)胞標(biāo)記后成脂能力。使用MTT比色分析法檢測標(biāo)記前后細(xì)胞的增殖情況,同時(shí)將培養(yǎng)細(xì)胞上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)含量測定,檢測Ad.EGFP對(duì)細(xì)胞的毒性。

10、>　　 3、DA與海綿狀Ⅰ型膠原蛋白、纖維蛋白膠生物相容性的檢測
　　 將標(biāo)記后的DA分別與Ⅰ型膠原蛋白海綿支架、纖維蛋白膠體外聯(lián)合培養(yǎng),測定細(xì)胞在支架上的黏附率,相差顯微鏡及電子顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞在支架上黏附、伸展、生長和增殖情況；使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活力,油紅0染色檢測細(xì)胞復(fù)合支架后成脂能力。
　　 4、體內(nèi)工程化脂肪組織的構(gòu)建
　　 將Ⅰ型膠原支架與纖維蛋白膠可注射支架分別與GFP標(biāo)記的成脂誘導(dǎo)后DA

11、或ASCs混合,設(shè)空白支架為對(duì)照組,同體雙側(cè)植入裸鼠背部皮下,12周后取出植入物。進(jìn)行組織工程新生物大體觀察和濕重測定后熒光顯微鏡觀察大體組織標(biāo)本,最后組織學(xué)檢測、HE染色定性。血管計(jì)數(shù)法檢測新生物血管密度。
　　 結(jié)果：
　　 1.分離培養(yǎng)的DA形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞,具有很強(qiáng)的增殖及多向分化能力。在脂肪、成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下,分化出成熟的脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞,油紅0、茜素紅染色陽性。細(xì)胞誘導(dǎo)分化前,DA內(nèi)PPARγ

12、、C/EBPβ的表達(dá)高于ASCs,而RUNX2、SOX9的表達(dá)低于ASCs。細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后,DA內(nèi)PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、Leptin、LPL的基因表達(dá)始終高于ASCs,增加的幅度更大；而成骨誘導(dǎo)后,ASCs內(nèi)RUNX2的表達(dá)水平始終高于DA。
　　 2.Ad.EGFP可成功進(jìn)入DA。24h可見綠色熒光,5d熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯較高,DA傳代后仍有強(qiáng)熒光表達(dá)。轉(zhuǎn)染DA后,不影響其增殖活性。MOI為0、10、20、30

13、、50、100時(shí)轉(zhuǎn)染率分別為0％、11.3％、28.5％、43.7％、95.8％、96.3％。細(xì)胞標(biāo)記后不影響向脂肪細(xì)胞分化的能力。
　　 3.DA可以在海綿狀Ⅰ型膠原蛋白支架、纖維蛋白膠支架上生長并逐漸黏附,細(xì)胞與不同的支架混合,細(xì)胞在支架上的黏附率也不同:DA在海綿狀Ⅰ型膠原蛋白支架組(n=6)的細(xì)胞黏附率為77.67％±3.33％；DA在纖維蛋白膠組(n=6)的細(xì)胞黏附率為91.83％±2.79％,兩組采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比

14、較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.996,P<0.001)。而DA在海綿狀Ⅰ型膠原蛋白支架組(n=6)的細(xì)胞成脂分化率為63.0％±3.0％；DA在纖維蛋白膠組(n=6)的細(xì)胞成脂分化率為63.2％±3.3％,兩組采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較無顯著性差異(t=0.091,P=0.929)。DA與支架混合培養(yǎng)后不影響細(xì)胞的形態(tài)、生長增殖狀況,細(xì)胞與支架復(fù)合后不影響向脂肪細(xì)胞分化的能力。
　　 4.術(shù)后12w取材發(fā)現(xiàn),DA-膠原蛋白組、ASCs

15、-膠原蛋白組、DA-纖維蛋白膠組、ASCs-纖維蛋白膠組于移植物包埋區(qū)均可觀察到新生組織形成；空白對(duì)照組(完全培養(yǎng)基-膠原支架組、完全培養(yǎng)基-纖維蛋白膠組)均未見新生組織形成。DA-膠原蛋白組(n=6)新生組織平均濕重為0.0728±0.0184g；ASCs-膠原蛋白組(n=6)新生組織平均濕重為0.0732±0.0198g；DA-纖維蛋白膠組(n=6)新生組織平均濕重為0.1109±0.0020g,ASCs-纖維蛋白膠組(n=6)新生

16、組織平均濕重為0.1080±0.0028g。DA-膠原蛋白組與ASCs-膠原蛋白組、DA-纖維蛋白膠組與ASCs-纖維蛋白膠組之間濕重比較,無顯著性差異(均為P>0.05)。HE染色證實(shí)新生組織均為成熟脂肪組織,支架已完全吸收降解:免疫熒光染色陽性證實(shí)新生組織為外源性。各組新生微血管密度分別為:DA-膠原蛋白組11.22±2.53；ASCs-膠原蛋白組15.22±2.39；DA-纖維蛋白膠組10.72±2.42；ASCs-纖維蛋白膠組1

17、5.00±2.54。DA-膠原蛋白組與ASCs-膠原蛋白組、DA-纖維蛋白膠組與ASCs-纖維蛋白膠組之間微血管密度比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。各組新生物纖維化程度分別為:DA-膠原蛋白組24.90％±0.49％；ASCs-膠原蛋白組25.10％±0.73％;DA-纖維蛋白膠組25.00％±0.75％;ASCs-纖維蛋白膠組24.70％±0.72％。DA-膠原蛋白組與ASCs-膠原蛋白組、DA-纖維蛋白膠組與ASCs-纖維

18、蛋白膠組之間纖維化程度比較,無顯著性差異(均為P>0.05)。在體內(nèi),DA表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記——CD31,參與血管的形成。
　　 討論：
　　 種子細(xì)胞是構(gòu)建組織工程脂肪核心問題之一。在脂肪組織中成熟脂肪細(xì)胞已被證實(shí)能去分化為DA,DA具有強(qiáng)增殖能力,多向分化能力,高成脂分化率。本實(shí)驗(yàn)從人脂肪組織成功獲取脂肪細(xì)胞,天花板貼壁培養(yǎng)誘導(dǎo)去分化獲得DA。DA作為種子細(xì)胞與其他細(xì)胞相比具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)越性,該細(xì)胞來源廣泛、取材容易

19、,大量獲取,高成脂分化率。
　　 組織工程另一核心內(nèi)容是尋找具有組織再生潛力的支架材料。在生物材料方面,己開發(fā)和研制了適用于不同組織構(gòu)建的生物支架材料。各類材料都具有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),而膠原蛋白在組織工程構(gòu)建中作為支架材料的效果已被肯定。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,顯示膠原蛋白作為支架材料與ASCs有良好的相容性及黏附性,對(duì)細(xì)胞無毒性,不影響細(xì)胞增殖。
　　 同時(shí),細(xì)胞標(biāo)記一直是困擾組織工程技術(shù)修復(fù)機(jī)制研究的一大難題,其在干細(xì)胞來源的

20、種子細(xì)胞的缺損修復(fù)研究中尤為重要。尋找一種直觀、長期穩(wěn)定,同時(shí)不影響細(xì)胞組織形成能力的標(biāo)記方法非常重要。在本實(shí)驗(yàn)中,EGFP對(duì)DA成功進(jìn)行了標(biāo)記,且具有上述優(yōu)點(diǎn)。
　　 在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,脂肪分化誘導(dǎo)后的DA與ASCs一樣,與Ⅰ型膠原、或纖維蛋白膠支架混合培養(yǎng)后能在裸鼠皮下新生結(jié)構(gòu)功能完整的脂肪組織塊。該研究提示,DA作為種子細(xì)胞的確可以應(yīng)用于脂肪組織的組織工程研究,并且能合成具有三維結(jié)構(gòu)及功能的脂肪組織。
　　 結(jié)論：

21、r>　　 1、本實(shí)驗(yàn)成功地從人皮下脂肪組織中誘導(dǎo)培養(yǎng)出DA,建立了一整套有關(guān)DA分離、培養(yǎng)和鑒定的較簡便的方法。DA具有很強(qiáng)的增殖和自我更新能力,具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的潛能,尤其是高成脂分化力。DA來源豐富、取材容易,創(chuàng)傷小,是理想的組織工程種子細(xì)胞,具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 2、腺病毒是較好的基因載體,是一個(gè)高效、安全快捷的基因修飾操作系統(tǒng),EGFP在DA中能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),將為基因治療和細(xì)胞示蹤提供有效的

22、實(shí)驗(yàn)方法。EGFP對(duì)細(xì)胞無毒副作用,安全性高,對(duì)細(xì)胞的生長增殖及成脂分化無明顯影響。
　　 3、DA可以在海綿狀Ⅰ型膠原蛋白、纖維蛋白膠支架上逐漸黏附,細(xì)胞黏附率高,生長、增殖良好。支架對(duì)細(xì)胞無毒性反應(yīng)。海綿狀Ⅰ型膠原蛋白、纖維蛋白膠材料與DA之間具有良好的生物相容性。
　　 4、以膠原蛋白和可注射型纖維蛋白膠為支架材料,復(fù)合體外培養(yǎng)的人DA,能在體內(nèi)成功構(gòu)建成熟的脂肪組織塊,并證實(shí)細(xì)胞參與血管內(nèi)皮的構(gòu)成。該研究提示,D