重組irisin促進(jìn)白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉(zhuǎn)變及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 Irisin通過P38 MAPK，ERK途徑促進(jìn)小鼠白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)變
　　目的:
　　在畢赤酵母中建立高效的重組irisin表達(dá)體系，在體外研究重組irisin在脂肪細(xì)胞棕色化過程中的作用，并闡明其分子機(jī)制;體內(nèi)研究重組irisin對(duì)高脂飼養(yǎng)的肥胖小鼠的作用。
　　方法:
　　1.人重組irisin蛋白的表達(dá)與純化。
　　2.點(diǎn)突變irisin cD

2、NA以確定重組irisin糖基化位點(diǎn)。
　　3.培養(yǎng)大鼠原代脂肪細(xì)胞。
　　4.3T3L1脂肪前體細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。
　　5.重組irisin與脂肪細(xì)胞膜結(jié)合試驗(yàn)。
　　6.RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。
　　7.細(xì)胞免疫熒光染色(ICC)檢測(cè)irisin處理后成熟3T3L1細(xì)胞內(nèi)UCP1的表達(dá)。
　　8.Western blot檢測(cè)irisin處理后原代大鼠脂肪細(xì)胞及成熟3T3

3、L1細(xì)胞后，UCP1水平和信號(hào)通路蛋白的活化情況。
　　9.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察重組irisin對(duì)高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠白色脂肪棕色化、體重和糖耐量的影響。
　　10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本研究全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次及3次以上，結(jié)果使用單因素方差分析或Student's t檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.重組irisin表達(dá)和純化以及其糖基化:
　　(1)畢赤酵母可表達(dá)高濃度重組irisin。
　

4、　(2)考馬斯蘭染色顯示重組irisin具有分子量為15,22和25的三條帶。
　　(3)PNGase F去糖基化酶處理后，分子量為25和22的兩條帶消失。
　　(4)突變第7位和第52位天冬酰胺后，分子量為25的條帶消失。
　　2.重組irisin可以促進(jìn)大鼠原代脂肪細(xì)胞和成熟3T3L1細(xì)胞棕色化:
　　(1)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果顯示重組irisin處理大鼠原代脂肪細(xì)胞4天后， UCP1

5、基因和蛋白水平明顯增高，且呈濃度依賴性。
　　(2)實(shí)時(shí)定量PCR顯示irisin處理分化的3T3L1細(xì)胞4天后，諸多棕色脂肪標(biāo)志物基因水平明顯增高。
　　(3)Western blot和ICC結(jié)果顯示，irisin處理后，成熟3T3L1細(xì)胞內(nèi)UCP1水平明顯增高。
　　(4)實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot結(jié)果顯示突變重組irisin的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)后，其棕色化功能較未突變者降低。
　　3.ERK和p38

6、 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路參與Irisin誘導(dǎo)的白色脂肪組織棕色化:
　　(1)Western blot結(jié)果顯示，Irisin處理原代大鼠脂肪細(xì)胞和成熟3T3L1細(xì)胞5,10，20，30分鐘后，兩種脂肪細(xì)胞的磷酸化ERK和p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯升高。
　　(2)用ERK抑制劑U0126和p38抑制劑SB203580分別抑制irisin誘導(dǎo)的ERK和p38磷酸化后，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種

7、抑制劑均明顯降低irisin所致的UCP1增加。
　　4.免疫熒光結(jié)果顯示irisin可以結(jié)合在成熟3T3L1細(xì)胞的胞膜上。
　　5.重組irisin可以調(diào)節(jié)高脂飼養(yǎng)的肥胖小鼠體重及葡萄糖穩(wěn)態(tài):
　　(1)向高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠腹腔注射重組irisin14天，諸多棕色脂肪標(biāo)志基因明顯增高。
　　(2)免疫組化結(jié)果顯示腹腔注射重組irisin后，UCP1表達(dá)明顯增高。
　　(3)注射重組irisin后，肥胖小鼠

8、體重降低。
　　(4)腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(IGPTT)結(jié)果顯示，注射irisin后，小鼠糖耐量得到明顯改善。
　　(5)注射重組irisin后，肥胖小鼠空腹胰島素水平降低。
　　結(jié)論:
　　1.畢赤酵母可以高濃度表達(dá)重組irisin蛋白，且重組irisin蛋白具有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)。
　　2.重組Irisin可以促進(jìn)大鼠原代脂肪細(xì)胞和成熟3T3L1脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣炯?xì)胞。
　　3.Irisin的棕

9、色化功能是通過活化ERK MAPK和p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　4.脂肪細(xì)胞膜上或許有irisin受體存在。
　　5.重組Iris in可以降低高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠體重并改善其葡萄糖穩(wěn)態(tài)。
　　第二部分 Irisin對(duì)人原代皮下脂肪的棕色化作用
　　目的:
　　研究Irisin對(duì)人皮下白色脂肪組織(scWAT)影響及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.重組irisin蛋白的制備。

10、　　2.人scWAT的獲取
　　3.人原代脂肪細(xì)胞的分離及培養(yǎng)。
　　4.人原代脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化。
　　5.新鮮脂肪組織塊的培養(yǎng)及Irisin對(duì)其處理.
　　6.RNA提取及實(shí)時(shí)定量qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá).
　　7.免疫熒光染色檢測(cè)Irisin處理后分化成熟人脂肪細(xì)胞內(nèi)UCP1的表達(dá)。
　　8.Western blot檢測(cè)Irisin處理后人皮下白色脂肪組織塊中UCP表達(dá)和信號(hào)

11、通路蛋白的表達(dá)。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本研究所涉及實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次及3次以上，結(jié)果采用單因素方差分析或Sudents't檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.人成熟脂肪細(xì)胞的獲取。
　　2.重組Irisin可以促進(jìn)scWAT源的人成熟脂肪細(xì)胞棕色化:
　　實(shí)時(shí)定量PCR和免疫熒光結(jié)果顯示重組irisin處理人成熟脂肪細(xì)胞4天后，UCP1基因和蛋白水平明顯增高.
　　3.重組ir

12、isin抑制脂肪前體細(xì)胞分化和棕色化:
　　在原代脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化整個(gè)過程中加入重組irisin處理18天，成熟的脂肪細(xì)胞數(shù)目較未處理組明顯減少，白色脂肪細(xì)胞分化的相關(guān)基因表達(dá)明顯降低，同時(shí)UCP1基因和蛋白水平也均明顯降低。
　　4.Irisin通過激活ERK和p38信號(hào)通路促進(jìn)新鮮皮下白色脂肪塊棕色化:
　　(1)重組irisin處理新鮮皮下脂肪塊4天后，western blot檢測(cè)UCP1蛋白水平明

13、顯增高，且不同人對(duì)irisin反應(yīng)不同。
　　(2)Western blot結(jié)果顯示，Irisin分別處理新鮮皮下脂肪塊10，20，30，60分鐘后，脂肪組織中磷酸化ERK和p38水平均明顯升高。
　　(3)用U0126（ERK抑制劑）和SB203580(p38抑制劑)分別抑制irisin誘導(dǎo)的ERK和p38磷酸化后， Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種抑制劑均明顯降低irisin所致的UCP1增加。
　　5.

14、人皮下脂肪組織中褐色基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平和對(duì)irisin刺激后的棕色化反應(yīng)正相關(guān):
　　(1)定量PCR顯示不同人來源的脂肪組織塊對(duì)重組Iris in所引起的棕色化反應(yīng)不同。
　　(2)不同人來源的脂肪組織塊褐色脂肪基因的基礎(chǔ)水平表達(dá)不同。
　　(3)人皮下脂肪組織中褐色基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平和對(duì)irisin刺激后的棕色化反應(yīng)正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.重組irisin可以促進(jìn)人皮下成熟脂肪細(xì)胞棕色化。