VEGF-,165-基因轉染脂肪干細胞促進工程化脂肪組織的血管化研究.pdf

1、研究背景: 組織工程是應用細胞生物學和工程學原理，對病損組織結構和功能的修復與重建進行研究開發(fā)的一門新興學科。 對血循環(huán)的重建而言，血管內皮細胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)作為血管內皮細胞的特異性絲裂原是血管形成最重要的調節(jié)因子，在新生血管形成過程中起重要作用[2]，而通過將VEGF編碼基因導入細胞的基因修飾已成為獲得血循環(huán)重建的最具發(fā)展?jié)摿Φ闹委熌Ｊ街弧?

2、 國外有些研究機構開始嘗試將細胞移植與生長因子聯合應用，并獲得很好的療效[3]。 研究目的: 1.研究從成人脂肪抽吸物液體部分中獲取的脂肪組織來源干細胞(adipose-derivedstemcell，ASCs)作為脂肪組織工程理想種子細胞的優(yōu)勢。 2.對ASCs進行腺病毒重組增強型綠色熒光蛋白(recombinedadenovirus-enhancedgreenfluorescentprotein，Ad-EGF

3、P)體外轉染和標記，觀察其對細胞生物性狀的影響，為脂肪干細胞研究尋找理想的細胞標記方法。 3.探討腺病毒為載體對種子細胞進行VEGF165基因修飾的可行性。 4.利用I型膠原蛋白作支架材料和ASCs在體內構建組織工程化脂肪的可行性。 5.通過VEGF165基因修飾干預組織工程脂肪組織血管形成，評價促進組織工程脂肪血管形成的效果，使再生的脂肪組織內部獲得血供能力而保證其長期穩(wěn)定存活，提高組織工程化脂肪成活水平。

4、 材料與方法: 1.ASCs的分離培養(yǎng)及鑒定取人吸脂術抽吸物的液體部分，使用直接離心過濾法進行原代培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)及功能變化，細胞傳至第4代后供實驗用。利用流式細胞儀檢測細胞表面部分與干細胞相關的分子，確定細胞類型；臺盼藍拒染法測細胞活性并繪制細胞生長曲線；同時對細胞進行體外定向成脂、成骨、成軟骨誘導分化，并以油紅0染色、茜素紅染色和阿新藍染色進行鑒定。 2.Ad.E6FP轉染并標記ASCsAd.EGFP按不同感染

5、復數(multiphciyofinfection，MOI)值體外轉染ASCs，進行EGFP熒光標記，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細胞生長情況及傳代后熒光強度的變化；測定腺病毒轉染ASCs的效率；檢測細胞標記后成脂能力。使用臺盼藍拒染法檢測細胞活力和繪制細胞生長曲線，同時將培養(yǎng)細胞上清液進行乳酸脫氫酶(LDH)含量測定，檢測Ad.EGFP對細胞的毒性。 3.Ad.VEGF165基因轉染ASCs后目的基因表達按上述試驗確定的MOI值(

6、50)進行Ad.VEGF165體外轉染ASCs，通過免疫細胞熒光檢測VEGF在細胞內的表達情況；同時利用ELISA測定細胞培養(yǎng)上清液中VEGF濃度水平。 4.I型膠原構建工程化脂肪的實驗研究將脂肪干細胞接種于支架材料形成復合物，將培養(yǎng)細胞上清液進行乳酸脫氫酶(LDH)含量測定，檢測材料的細胞毒性；細胞-支架粘附率檢測；最后掃描電鏡觀察細胞與載體的黏附性。在確定細胞和支架材料生物相容性較好的情況下，準備三組植入物(細胞被EGFP標

7、記)：Ⅰ組為空支架，Ⅱ組為ASCs和支架，Ⅲ組為成脂分化的ASCs和支架，分別在不同部位植入同一裸鼠皮下。在8w取新生標本，進行組織工程新生物大體觀察和濕重測定后，熒光顯微鏡觀察大體組織標本，最后組織學檢測、油紅0染色定性。 5.VEGF165促進工程化脂肪血管新生準備三組植入物：IV組為成脂分化的ASCs和支架，V組為EGFP基因轉染的ASCs、成脂分化的ASCs和支架，VⅠ組為VEGF165基因轉染的ASCs、成脂分化的AS

8、Cs和支架。分別植入同一裸鼠皮下。按2w、12w取新生標本，通過大體觀察、HE染色和免疫熒光觀察新生組織結構和血管生長情況。 結果: 1.吸脂物液態(tài)部分分離培養(yǎng)的ASCs形態(tài)類似于成纖維細胞，具有很強的增殖及多向分化能力。在脂肪、成骨及成軟骨分化誘導培養(yǎng)基的作用下，分化出成熟的脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞，油紅0、茜素紅染色和阿新藍染色陽性。實驗檢測到細胞表面抗原分子CD29、CD44持續(xù)表達，說明ASCs具有干細胞特性

9、。 2.Ad.EGFP可成功進入AASCs。24h可見綠色熒光，5d熒光表達強度明顯較高，ASCs傳代后仍有強熒光表達。轉染ASCs后，不影響其增殖活性。MOI為0、10、20、30、50、100時轉染率分別為0％，10.3％，26.6％，47.6％，94.7％，96.8％。 3.經免疫熒光和ELISA檢測證實腺病毒能成功地將人VEGF165基因轉染至人ASCs中，并獲得有效的表達。 4.支架與ASCs有良好的相

10、容性及黏附性，對細胞無毒性，不影響細胞增殖。8w時，Ⅰ組植入物已降解，II和Ⅲ組均有新生組織形成，Ⅱ組新生物平均濕重為18.83±0.71mg，Ⅲ組新生物平均濕重為21.10±1.16mg；Ⅲ組比Ⅱ組形成的脂肪組織結構更完整及更多。II和Ⅲ組相互間均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。常規(guī)病理切片及油紅0染色均證實有脂肪組織形成，EGFP熒光顯色陽性。 5.術后2w，IV、V、VⅠ組的脂肪組織存活濕重分別為20.85±1.35mg，2

11、2.52±0.75mg，22.95±0.79mg。IV與VⅠ組，P<0.01；IV與V組P<0.05；V與VⅠ組，P>0.05。血管計數顯示：組IV的血管密度為6.50±2.07個／HPF；組V為9.56±2.73個／HPF；組VI為12.00±2.45個／HPF。術后12w，IV、V、VⅠ組的脂肪組織存活濕重分別為13.53±1.16mg，21.20±1.00mg，22.80±0.72mg;IV與V、VⅠ組，P<0.01；V與VⅠ組，

12、P<0.05；VⅠ組與V組脂肪組織血管密度有顯著差異(P<0.01)，均高于IV(P<0.01)。血管計數顯示：11.11±1.94個／HPF；組V為15.55±2.77個／HPF；組VI為18.39±3.73個／HPF。在體內，ASCs這些細胞表達內皮細胞表面標記--CD31，參與血管的形成。 討論: 種子細胞的大量獲取是構建組織工程脂肪核心問題之一。在脂肪組織中已被證實包含具有多向分化潛力的細胞，并有研究已經證實在脂

13、肪基質中包含有多能干細胞。這種干細胞被命名為脂肪組織來源干細胞，縮寫為ASCs。本實驗從抽脂術液態(tài)部分成功獲取ASCs。ASCs作為種子細胞與其他細胞相比具有相當的優(yōu)越性，該細胞來源廣泛、取材容易，大量獲取，受干擾小。 組織工程另一核心內容是尋找具有組織再生潛力的支架材料。在生物材料方面，己開發(fā)和研制了適用于不同組織構建的生物支架材料。各類材料都具有各自的優(yōu)點和缺點，而膠原蛋白在組織工程構建中作為支架材料的效果已被肯定。在這個實

14、驗中，顯示膠原蛋白作為支架材料與ASCs有良好的相容性及黏附性，對細胞無毒性，不影響細胞增殖。 同時，細胞標記一直是困擾組織工程技術修復機制研究的一大難題，其在干細胞來源的種子細胞的缺損修復研究中尤為重要。尋找一種直觀、長期穩(wěn)定，同時不影響細胞組織形成能力的標記方法非常重要。在本實驗中，EGFP對ASCs成功進行了標記，且具有上述優(yōu)點。 另外，VEGF應用方式一般可分為直接應用和間接應用。直接應用VEGF有其局限性：①V

15、EGF價格昂貴；②難以在體內保持持續(xù)的有效濃度；③不能自我調節(jié)。若因子不能持續(xù)有效地支持新生血管網的形成，就不能防止血管形成后的退化和塌陷。而間接應用是利用基因轉染技術將基因整合進宿主細胞，將一些能產生VEGF的細胞種植在局部組織，使其在較長時間內持續(xù)、穩(wěn)定地產生VEGF。能很好地克服直接應用的缺陷。在這個實驗中，我們利用基因轉染技術，通過基因載體--腺病毒把VEGF165基因成功轉入ASCs內，ASCs能大量、穩(wěn)定且持續(xù)較長時間分泌V

16、EGF。 本實驗結果表明，通過腺病毒介導，將VEGF165基因轉染到體外培養(yǎng)的人ASCs中，應用脂肪組織工程植入物聯合移植裸鼠皮下的動物實驗模型，發(fā)揮了基因的治療性血管形成作用，促進了工程化脂肪組織的血管新生，血供的及時重建，進而提高其移植存活水平及存活質量。同時通過大體標本及組織學檢測，未發(fā)現有血管瘤等病變發(fā)生，提示此治療是安全的。 結論： 1.從成人脂肪抽吸物液體部分中獲取的ASCs，從采集到培養(yǎng)都具有明顯優(yōu)

17、勢，將會為脂肪組織工程提供比較理想的種子細胞。 2.腺病毒是較好的基因載體，是一個高效、安全快捷的基因修飾操作系統(tǒng)，EGFP在ASCs中能持續(xù)穩(wěn)定表達，將為基因治療和細胞示蹤提供有效的實驗方法。 3.轉染VEGF165基因的ASCs能大量、穩(wěn)定且持續(xù)較長時間分泌VEGF，能為血管形成提供豐富穩(wěn)定的血管生成因子。 4.從抽脂術液態(tài)部分獲取的ASCs能夠滿足脂肪組織工程的種子細胞要求，而所選用的I型膠原支架能在裸鼠體