腺病毒介導(dǎo)VEGF-,165-基因和eGFP基因共轉(zhuǎn)染hBMSc對(duì)其體外增殖分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 (1)體外構(gòu)建血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF165基因腺病毒載體。 (2)對(duì)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(hBMSc)進(jìn)行體外培養(yǎng)及擴(kuò)增，觀察其原代及傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)及生物學(xué)特點(diǎn)。 (3)將VEGF165基因腺病毒載體共轉(zhuǎn)染hBMSc，觀察其表達(dá)。 (4)觀察轉(zhuǎn)染對(duì)hBMSc增殖、分化的影響。(5)觀察eGFP示蹤轉(zhuǎn)染效率及VEGF165的表達(dá)。 方法 (1)通過(guò)PCR方法人工合成VEGFV65的c

2、DNA序列。合成完整的基因序列，測(cè)序。合成的VEGF165兩端帶有EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)，并克隆到pMD18-T載體中，對(duì)pMD18-T-VEGF165進(jìn)行雙酶切。把含有pDNR質(zhì)粒(含eGFP基因)的菌液接種到LB培養(yǎng)基，用試劑盒提質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和BamHI的雙酶切?；厥?.6Kb左右的片段，與合成的帶有EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)的VEGF165連接，過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，鑒定，構(gòu)建pDNR-VEG

3、F165載體。通過(guò)Cre-loxP系統(tǒng)介導(dǎo)與pDNR-VEGF165之間的重組。pInt.AV1.spat與pDNR-VEGF165共轉(zhuǎn)化BNN菌株的感受態(tài)細(xì)胞，在細(xì)菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)重組。挑選單克隆，進(jìn)行酶切鑒定，構(gòu)建pInt.AV1.sPAT.VEGF165腺病毒表達(dá)載體。復(fù)蘇并擴(kuò)增293細(xì)胞。 (2)骨髓取自早產(chǎn)死胎采用全骨髓法進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，傳代后改用含地塞米松(10-8mol/L)、B-甘油磷酸鈉(10mmol/L)和維生C(50

4、mg/L)的條件培養(yǎng)基促使其向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。 (3)實(shí)驗(yàn)分為三組：①VEGF185和eGFP基因轉(zhuǎn)染hBMSc組；②空腺病毒載體轉(zhuǎn)染hBMSc組；③單純hBMSc組。相差顯微鏡和光鏡下進(jìn)行HE染色組織學(xué)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)變化。將傳至第2代培養(yǎng)的細(xì)胞各以0.5×104/孔，接種于24孔板中，次日起選擇4個(gè)復(fù)孔細(xì)胞，分別于接種后2、4、6、8d進(jìn)行MTT檢測(cè)。 結(jié)果 (1)通過(guò)PCR技術(shù)合成VEGF165基因，

5、合成的VEGF165基因克隆到PMD18-T載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，所克隆的VEGF165序列在NCBIBLAST進(jìn)行相似性在線分析，發(fā)現(xiàn)與報(bào)道的Homosapiensvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)(VEGF165，NM_001025368gi：71051580)的序列完全相同。進(jìn)行PMD18-T載體擴(kuò)增。合成的VEGF165兩端帶有EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)，并克隆到2.7Kb的pMD18-T載體

6、中，對(duì)pMD18-T-VEGF165進(jìn)行雙酶切。電泳結(jié)果可見(jiàn)，600bp的VEGF165基因已經(jīng)插入到2.7Kb的pMD18-T載體中。提取pInt.AV1.sPAT.VEGF165質(zhì)粒后，對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI酶切分析，電泳結(jié)果可見(jiàn)獲得了7.9kb長(zhǎng)度的重組質(zhì)粒。受體質(zhì)粒pInt.AV1.SpaT上只有一個(gè)EcoRI單酶切位點(diǎn)，而整合進(jìn)pInt.AV1.SpaT質(zhì)粒上的基因VEGF185上也只有一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。從理論上分析，如

7、果重組質(zhì)粒VEGF165被位點(diǎn)特異性地重組到受體質(zhì)粒pInt.AV1.SpaT上，用EcoRI酶切將會(huì)從重組質(zhì)粒上切下來(lái)一段1kb大小的片段，剩余的片段大小約為6.9kb。重組質(zhì)粒用EcoRI酶切后，切成兩條片段，大小約為1kb和6.9kb，實(shí)際的酶切分析結(jié)果與理論分析相符，從而證明了轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒為Cre-LoxP系統(tǒng)介導(dǎo)的含有VEGF165基因的重組質(zhì)粒。 (2)倒置相差顯微鏡下，細(xì)胞接種的最初數(shù)日，培養(yǎng)物中造血細(xì)胞較多

8、，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，其中有少量呈成纖維細(xì)胞樣外形的貼壁細(xì)胞，以后這些細(xì)胞呈克隆生長(zhǎng)。在細(xì)胞傳代培養(yǎng)中使用條件培養(yǎng)基，細(xì)胞增殖速度略低于使用完全培養(yǎng)基組。傳代后貼壁。使用條件培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5-7d后細(xì)胞融合成單層，誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后形成不透光的鈣結(jié)節(jié)。HE染色后光鏡下觀察，培養(yǎng)的hBMSc呈梭形、多角形，有多個(gè)突起，胞漿淡藍(lán)色，含有較大的顆粒，核可見(jiàn)數(shù)個(gè)深藍(lán)色的核仁，細(xì)胞分裂相多見(jiàn)。掃描電鏡觀察開(kāi)始傳代培養(yǎng)數(shù)天的細(xì)胞多為單層細(xì)胞結(jié)

9、構(gòu)，多為梭形或多角形，有數(shù)個(gè)突起，胞體表面有顆粒狀物，細(xì)胞上及細(xì)胞間可見(jiàn)鈣鹽結(jié)晶沉積。培養(yǎng)5-7d的細(xì)胞呈多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，連接成片，細(xì)胞間可見(jiàn)絲狀纖維相互連接，并有白色團(tuán)塊狀鈣鹽沉積。從傳代培養(yǎng)第2、4、6代細(xì)胞MTT法檢測(cè)結(jié)果可以看出，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力有所下降(p＜0.05)。Westernblot印跡顯示：轉(zhuǎn)染組在50KD處出現(xiàn)特征性條帶，而空載體組和空白對(duì)照組未見(jiàn)條帶。 (3)倒置相差顯微鏡下，三組細(xì)胞外形

10、沒(méi)有明顯差異，形態(tài)基本一致。HE染色后光鏡下觀察，三組細(xì)胞外形沒(méi)有明顯差異，形態(tài)基本一致。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞數(shù)量都有所增加，各時(shí)間點(diǎn)經(jīng)VEGF165基因轉(zhuǎn)染的hBMSc吸光度值無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。經(jīng)轉(zhuǎn)染基因的hBMSc與轉(zhuǎn)染空載體、未轉(zhuǎn)染的hBMSc相比較，DNA合成前期細(xì)胞所占百分比無(wú)顯著性差異，反應(yīng)增殖活力的增殖指數(shù)PrI(包括DNA合成期、DNA合成后期和有絲分裂期)也無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。經(jīng)轉(zhuǎn)染的hBM

11、Sc堿性磷酸酶、骨鈣蛋白和層粘連蛋白合成與轉(zhuǎn)染空載體、未轉(zhuǎn)染的hBMSc相比較有顯著性差異(P＜0.05)，證實(shí)經(jīng)轉(zhuǎn)染的hBMSc堿性磷酸酶、骨鈣蛋白和層粘連蛋白合成明顯高于其它兩組。 結(jié)論 (1)成功利用動(dòng)態(tài)模板PCR基因合成法合成VEGF165基因，并利用含有eGFP基因中間載體pDNR質(zhì)粒通過(guò)Cre-loxP系統(tǒng)介導(dǎo)與pInt.AV1.spat在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)重組，獲得pInt.AV1.spat.VEGF165腺病毒表

12、達(dá)載體，經(jīng)包裝后重組腺病毒滴度(T)=90×109PFU/L。 (2)在本實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)的hBMSc具有典型成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和較強(qiáng)的生物學(xué)活性，向成骨細(xì)胞方向分化效率較高，細(xì)胞數(shù)量可以滿足骨組織工程研究的要求。 (3)eGFP基因轉(zhuǎn)染有效示蹤了VEGF165轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和hBMSc的效率。 (4)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了構(gòu)建的Ad-VEGF165感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后具有分泌VEGF165的能力，并獲得了轉(zhuǎn)VEGF165基