利用牙囊細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程牙周樣結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、牙周組織的再生從本質(zhì)上講就是牙周發(fā)育過程的再現(xiàn)，因此構(gòu)建組織工程牙周樣結(jié)構(gòu)必須模擬牙周發(fā)育時的微環(huán)境。牙囊細胞是牙周組織的前體細胞，可以分化為成牙骨質(zhì)細胞、成纖維細胞和成骨細胞。然而，目前對于牙囊細胞分化的機制還不清楚，對于牙囊細胞能否成為牙周組織工程的種子細胞還不明確。另外，脂肪間充質(zhì)干細胞具有取材方便、細胞量大、多向分化能力強、免疫源性低等諸多優(yōu)點，已經(jīng)引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。那么，這種細胞能否在牙周發(fā)育微環(huán)境的誘導(dǎo)下參與牙周組織的

2、再生？為了回答以上這些問題，本研究擬通過比較牙囊細胞與牙周膜細胞的異同，研究牙囊細胞分化的條件，來更深入地認識這種存在于牙周發(fā)育時期的細胞，探討牙周發(fā)育的微環(huán)境，并將所獲得的結(jié)果用來指導(dǎo)以牙囊細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞為種子細胞的工程化牙周組織的構(gòu)建，為今后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　本課題的研究內(nèi)容如下：
　　第一部分：牙囊細胞與牙周膜細胞的比較研究
　　目的：初步比較牙囊細胞和牙周膜細胞的異同。方法：復(fù)蘇凍存的第四代人牙

3、囊細胞和人牙周膜細胞，使用倒置顯微鏡進行細胞形態(tài)學(xué)觀察，使用流式細胞術(shù)檢測兩種細胞的表面分子表達，將細胞與陶瓷骨（CBB）復(fù)合，移植入裸鼠皮下，4周、6周后取材，組織學(xué)觀察。結(jié)果：兩種細胞均為成纖維細胞樣細胞，牙囊細胞胞體稍短，呈不規(guī)則的放射狀排列，牙周膜細胞胞體則更為細長，呈整齊規(guī)則的有序排列。造血系細胞標志CD11b、CD34、CD45在兩種細胞中呈陰性表達；間充質(zhì)細胞標志CD29、CD44、CD90、CD105在兩種細胞中均高表達

4、；牙周膜細胞CD14表達高于牙囊細胞（6.23％VS.2.72％），牙囊細胞STRO-1表達高于牙周膜細胞（20.99％VS.14.1％），牙囊細胞MACAM/CD146表達明顯高于牙周膜細胞（96.89％VS.17.11％）。兩種細胞與CBB復(fù)合后，在裸鼠皮下能夠生成非常相似的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)論：牙囊細胞與牙周膜細胞具有高度的同源性，兩者均來自外胚間充質(zhì)細胞；牙囊細胞與牙周膜細胞均含有干細胞成份，牙囊細胞中含有的未分化的間充質(zhì)干細胞更為豐

5、富；牙囊細胞與牙周膜細胞的分化，需要一定的外部條件進行誘導(dǎo)。
　　第二部分：牙本質(zhì)非膠原蛋白（dNCPs）對牙囊細胞的影響
　　目的：探討牙本質(zhì)基質(zhì)成份是否影響牙囊細胞的增殖與分化。方法：分離、培養(yǎng)出生后6～7dSD仔鼠的牙囊細胞，實驗組細胞用含有250μg/mldNCPs的培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)。之后開展一系列的體外實驗，包括細胞形態(tài)學(xué)觀察（倒置顯微鏡、掃描電鏡及透射電鏡觀察）、細胞增殖檢測（MTT、BrdU檢測及細胞周期分析）、

6、細胞礦化能力檢測（ALP活性檢測、vonKossa染色）、免疫細胞化學(xué)分析、RT-PCR檢測；建立牙囊細胞體內(nèi)分化模型，進行大鼠腎被膜下移植。結(jié)果：經(jīng)dNCPs誘導(dǎo)后，牙囊細胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變，增殖受到抑制，礦化能力增強，表達礦化相關(guān)的蛋白和基因，呈現(xiàn)成牙骨質(zhì)細胞特征，在牙本質(zhì)載體中生成大量的牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論：dNCPs能夠促進牙囊細胞向成牙骨質(zhì)細胞分化，這一結(jié)論補充了牙骨質(zhì)生成的經(jīng)典理論。
　　第三部分：牙胚根部細胞條件培養(yǎng)

7、液（ATGC-CM）對牙囊細胞的影響
　　目的：探討牙胚根部細胞條件培養(yǎng)液對牙囊細胞增殖與分化的影響。方法：分離培養(yǎng)出生后6～7dSD仔鼠的牙囊細胞，實驗組細胞用ATGC-CM進行誘導(dǎo)。體外實驗包括MTT檢測、流式細胞周期分析、ALP活性檢測、免疫細胞化學(xué)分析；體內(nèi)移植實驗利用牙囊細胞體內(nèi)分化模型，進行大鼠腎被膜下移植；移植物進行免疫組化染色。結(jié)果：經(jīng)ATGC-CM誘導(dǎo)后，細胞增殖受到抑制，ALP活性增強，表達礦化組織形成細胞和牙

8、周膜成纖維細胞的相關(guān)蛋白，在牙本質(zhì)載體中生成大量的骨樣組織和纖維組織，免疫組化染色確定該礦化組織為骨組織。結(jié)論：牙胚根部細胞條件培養(yǎng)液中含有多種與牙根牙周組織發(fā)育相關(guān)的生物活性因子；牙胚根部細胞條件培養(yǎng)液可以誘導(dǎo)牙囊細胞向成骨細胞、成纖維細胞分化。
　　第四部分：利用牙囊細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞體內(nèi)異位構(gòu)建牙周樣結(jié)構(gòu)的研究
　　目的：探討利用牙囊細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞體內(nèi)異位構(gòu)建牙周樣結(jié)構(gòu)的可行性。方法：用dNCPs和ATGC

9、-CM共同誘導(dǎo)大鼠牙囊細胞，之后將細胞與經(jīng)處理的牙本質(zhì)塊復(fù)合，由新型PLGA纖維膜包裹，移植入大鼠腎被膜下，術(shù)后4周、8周取材，組織學(xué)觀察；分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞；用dNCPs和ATGC-CM共同誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細胞，之后采取三種復(fù)合方式：①將脂肪間充質(zhì)干細胞與CBB復(fù)合；②與牙本質(zhì)塊復(fù)合，之后用PLGA膜包裹；③與脫礦骨管腔內(nèi)的牙本質(zhì)塊復(fù)合；移植入大鼠腎被膜下，術(shù)后4周、8周取材，進行組織學(xué)觀察。結(jié)果：經(jīng)誘導(dǎo)后，牙囊細胞

10、在牙本質(zhì)表面形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，有纖維組織垂直埋入其中，呈現(xiàn)牙骨質(zhì)/牙周膜樣結(jié)構(gòu)；分離、培養(yǎng)的大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞具有干細胞的特性；經(jīng)誘導(dǎo)后，脂肪間充質(zhì)干細胞可以在CBB、牙本質(zhì)塊表面形成牙骨質(zhì)/牙周膜樣結(jié)構(gòu)，牙本質(zhì)塊組更為明顯，在靠近脫礦骨一側(cè)生成骨樣組織。結(jié)論：牙囊細胞在一定的誘導(dǎo)條件下能夠形成牙骨質(zhì)/牙周膜樣結(jié)構(gòu)；通過異位組織工程的方法進行體內(nèi)構(gòu)建牙周樣結(jié)構(gòu)是可行的；脂肪間充質(zhì)干細胞是間充質(zhì)來源細胞，具有多向分化能力；脂肪間充質(zhì)干細