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文檔簡介
1、目的:
骨缺損,尤其大段骨缺損,其治療仍是骨科臨床所面臨的難題之一。傳統(tǒng)采用的植骨材料多缺乏生物活性,在體內(nèi)的降解速率快慢不一,促成骨作用往往有限。骨髓間充質(zhì)干細胞來源廣泛,取材方便,具有自我更新和多向分化的能力,體內(nèi)體外實驗均已證實其具有很強的成骨能力,是骨組織工程研究理想的種子細胞。骨誘導(dǎo)活性材料具有三維立體結(jié)構(gòu),生物相容性好,在體內(nèi)可降解,符合骨組織工程對生物支架材料的要求。目前,種子細胞與支架材料復(fù)合所面臨的問題是
2、,種子細胞的接種效率低下,流失量大,以及細胞在支架內(nèi)的不均勻分布。本課題采用骨誘導(dǎo)活性材料為載體,對人自體骨髓來源的間充質(zhì)干細胞進行體外三維培養(yǎng),構(gòu)建個體化的組織工程骨。同時,采用自體富含血小板血漿(PRP)作為種子細胞的雙相接種媒介,增加細胞的黏附和成骨,以構(gòu)建適合臨床應(yīng)用的組織工程骨,為骨缺損的臨床個體化移植治療提供有用的實驗數(shù)據(jù),具有重大的應(yīng)用前景。
方法:
1.人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。<
3、br> 采集骨髓,比較全骨髓貼壁和密度梯度離心兩種方法細胞分離效率,比較細胞在胎牛血清和自體血清中的生長,觀察細胞形態(tài)變化,流式檢測免疫表面標志物的表達。MTT法測定第3、5代細胞的增殖,繪制生長曲線。
2.人骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)分化及成骨能力研究。
取自體血清培養(yǎng)的第3代細胞,分別進行體外成脂和成骨誘導(dǎo)。鏡下觀察細胞形態(tài)變化,以油紅O染色檢驗細胞的成脂性,以Ⅰ型膠原、骨鈣素和鈣化結(jié)節(jié)檢驗細胞的成骨性
4、;比較成骨誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組細胞的ALP含量;RT-PCR檢測兩組的ALP和OPN mRNA表達。
3.人骨髓間充質(zhì)干細胞與骨誘導(dǎo)活性材料-富含血小板血漿凝膠復(fù)合物構(gòu)建組織工程骨的體外實驗研究。
以BrdU標記第3代細胞,用免疫細胞化學染色檢驗。取第3代細胞以傳統(tǒng)靜置接種法和PRP雙相接種法構(gòu)建細胞-生物支架復(fù)合物,比較兩組接種細胞的黏附率,測定兩組復(fù)合物的ALP含量差別;RT-PCR檢測兩組ALP和OPN m
5、RNA表達差別。以掃描電鏡觀察細胞在材料內(nèi)的生長增殖和基質(zhì)分泌情況。
4.人骨髓間充質(zhì)干細胞與骨誘導(dǎo)活性材料-富含血小板血漿凝膠復(fù)合物構(gòu)建組織工程骨的體內(nèi)實驗研究
以新西蘭大白兔建造股骨骨缺損動物模型,將構(gòu)建的組織工程骨分為3組:Ⅰ組為單純骨誘導(dǎo)材料組;Ⅱ組為傳統(tǒng)靜置法構(gòu)建工程骨組;Ⅲ組為雙相接種構(gòu)建工程骨組。分別移植入動物模型體內(nèi)修復(fù)骨缺損,觀察術(shù)后動物一般情況;X線檢查,觀察骨缺損處成骨情況;組織切片HE
6、染色觀察支架材料降解、新生骨生長情況。
結(jié)果:
1.經(jīng)全骨髓貼壁分離和密度梯度離心兩種方法都可成功分離細胞,自體血清培養(yǎng)和胎牛血清均可培養(yǎng)出成纖維樣細胞。MTT法生長曲線顯示第3、5代細胞均有較強的增殖能力。密度梯度離心自體血清培養(yǎng)的第5代細胞流式細胞儀檢測,其表達CD44、CD90,不表達CD34、CD45。
2.第3代人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)21天后,Ⅰ型膠原、骨鈣素和鈣化結(jié)節(jié)染色陽性;成
7、脂誘導(dǎo)21天后油紅O染色陽性;在成骨誘導(dǎo)過程中,ALP含量逐漸增高,與未誘導(dǎo)組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05);RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組均有ALP表達,未誘導(dǎo)組表達較弱,誘導(dǎo)組中有OPN表達,而未誘導(dǎo)組則無表達。
3.以BrdU標記第3代細胞,用免疫細胞化學染色陽性;以傳統(tǒng)靜置接種法和PRP雙相接種法構(gòu)建細胞-生物支架復(fù)合物,分別比較細胞接種4h,8h,12h,24h后細胞粘附率,后者高于前者,有統(tǒng)計學差異(P
8、<0.05);兩種方法接種細胞成骨誘導(dǎo)后ALP含量逐漸增高,后者高于前者,有統(tǒng)計學差異(P<0.05);RT-PCR結(jié)果顯示兩種方法接種誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組均有ALP和OPN表達,但未誘導(dǎo)組表達較弱;掃描電鏡觀察PRP雙相接種法構(gòu)建組織工程骨,細胞在材料表面生長,并可延入材料孔隙之中,有基質(zhì)分泌。
4.各組組織工程骨植入兔股骨骨缺損處,傷口生長良好一期愈合,無不良反應(yīng)。X線顯示實驗組在術(shù)后12周基本達到骨愈合,對照組在術(shù)后12
9、周時愈合可,空白組骨愈合不滿意。HE染色觀察到空白組8周后骨誘導(dǎo)活性材料基本被吸收,對照組和實驗組8周起可見支架的材料降解和新生骨組織,12周可見實驗組成骨更好。
結(jié)論:
1.密度梯度離心法分離和自體血清培養(yǎng)獲得的成分均一、增殖能力強的人骨髓間充質(zhì)干細胞可作為種子細胞。
2.富含血小板血漿雙相接種法可促進人骨髓間充質(zhì)干細胞與骨誘導(dǎo)活性材料的黏附及成骨,有利于構(gòu)建組織工程骨。
3.構(gòu)
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