丙戊酸致骨肉瘤細(xì)胞輻射增敏作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　骨肉瘤(osteosarcoma)主要好發(fā)于20歲以下青少年與兒童，是一種惡性骨腫瘤，臨床上主要用放療來治療，但由于骨肉瘤對(duì)輻射有一定抵抗性，因此效果并不理想。為增強(qiáng)輻射對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，尋找有效的輻射增敏劑成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。在臨床上，丙戊酸(Valproic Acid，VPA)是一種治療癲癇病和其他痙攣性疾病的常見藥物，也是最具代表性的一類組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhi

2、bitors，HDACis)。我們課題組及其他研究小組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明，VPA能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性。我們課題組研究還揭示在治療癲癇病的安全血藥濃度(0.3-0.8mM)下的VPA對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞輻射增敏作用與DNA損傷修復(fù)功能障礙有關(guān)，主要是破壞修復(fù)DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks，DNA DSBs）的同源重組(homologous recombination

3、，HR)分子機(jī)制。但是，HDACis對(duì)骨肉瘤細(xì)胞輻射增敏作用目前還不十分清楚。為此，本課題將探討安全劑量(0.5 mM)與安全臨界劑量(1.0 mM)下的VPA對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞輻射敏感性的作用，以及VPA輻射增敏作用是否與干擾HR和非同源末端連接(non-homologousend-joining，NHEJ)兩種修復(fù)機(jī)制有關(guān)，目的在于為VPA用于骨肉瘤臨床放射治療提供重要的理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法
　　1.細(xì)胞克隆

4、形成實(shí)驗(yàn)觀察VPA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS輻射敏感性的影響
　　單獨(dú)VPA組是指給予0.5 mM的VPA作用于U2OS細(xì)胞24 h;單獨(dú)電離輻射(inozing radiation，IR)組是指用0、2 Gy、4Gy及6 Gy輻射劑量處理細(xì)胞，聯(lián)合組是先給予U2OS細(xì)胞0.5 mM VPA作用24 h再分別給予0、2Gy、4 Gy及6 Gy輻射劑量處理，每組設(shè)三個(gè)平行樣品。處理結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)14天，統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞克隆形成率。
　　

5、2.彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VPA對(duì)IR所致的U2OS細(xì)胞DSBs損傷的影響
　　單獨(dú)VPA組是指VPA作用U2OS細(xì)胞24 h，單獨(dú)IR組是用4 Gy輻射劑量處理細(xì)胞;聯(lián)合組是先給予U2OS細(xì)胞0.5 mM VPA作用24 h再進(jìn)行4 Gy輻射劑量處理。收集各組細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞拖尾情況以及統(tǒng)計(jì)分析各組細(xì)胞的尾距變化。
　　3.DNA DSBs標(biāo)志物γH2AX與53BP1焦點(diǎn)形成，以及BRCA1焦點(diǎn)形成情況分

6、析
　　用0.5 mM VPA、8 Gy或VPA與IR聯(lián)合分別處理U2OS細(xì)胞，輻射后6h及24 h，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察各組細(xì)胞核內(nèi)γH2AX焦點(diǎn)、53BP1焦點(diǎn)以及BRCA1焦點(diǎn)形成情況，并統(tǒng)計(jì)各組含不同蛋白焦點(diǎn)的細(xì)胞百分率。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)VPA對(duì)細(xì)胞NHEJ修復(fù)效率的影響以及免疫印記技術(shù)檢測(cè)參與NHEJ機(jī)制的關(guān)鍵修復(fù)蛋白的表達(dá)
　　首先將I-SceI核酸酶轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá)非同源底物EJ5-GFP的U2OS

7、細(xì)胞系，造成DNA DSBs損傷，同時(shí)用0.5 mM VPA或1.0 mM VPA分別處理細(xì)胞，收集處理后的細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定VPA對(duì)細(xì)胞NHEJ修復(fù)效率的影響。收集各處理組細(xì)胞蛋白裂解液用免疫印記技術(shù)檢測(cè)NHEJ修復(fù)通路中主要蛋白KU70，KU80及DNA-PKcs蛋白表達(dá)水平。
　　5.熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測(cè)VPA對(duì)基因組穩(wěn)定性的影響
　　單獨(dú)VPA組的細(xì)胞給予0.5 mM的VPA并作用2

8、4 h;單獨(dú)IR組細(xì)胞給予2Gy輻射劑量處理，聯(lián)合組的細(xì)胞先給予0.5 mM VPA作用24 h再進(jìn)行2 Gy處理。輻射后24 h時(shí)，加入秋水仙堿使細(xì)胞停止于分裂期，收集分裂期細(xì)胞，按照常規(guī)FISH方法檢測(cè)染色體變異情況。
　　6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)VPA對(duì)細(xì)胞周期的影響
　　用0.5 mM和1.0 mM的VPA分別處理細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞，按照常規(guī)方法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果
　　1.VP

9、A能夠增加IR引起的骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)DNA DSBs損傷的進(jìn)一步蓄積
　　彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)VPA組，細(xì)胞DNA拖尾長(zhǎng)度有輕微增加，單獨(dú)IR組DNA尾距則有明顯增加，VPA與IR聯(lián)合處理組，細(xì)胞拖尾長(zhǎng)度為四組中最長(zhǎng)(P＜0.05)。與單獨(dú)IR組相比，在輻射后30 min和120 min，VPA與IR聯(lián)合處理組的細(xì)胞彗星拖尾長(zhǎng)度分別顯著增加14.02％(P＜0.05）和16.49％(P＜0.05)。
　　免疫熒光

10、結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，0.5 mM和1.0 mM VPA處理組含γH2AX焦點(diǎn)細(xì)胞的比率分別增加了1.2倍和1.3倍。輻射后6h結(jié)果表明，與單獨(dú)IR處理組相比，VPA與IR聯(lián)合組含有γH2AX焦點(diǎn)陽性細(xì)胞比率分別增加了1.6倍和2.1倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，0.5 mM和1.0 mM VPA處理組含有53BP1焦點(diǎn)的陽性細(xì)胞比率分別增加1.9倍和2.7倍(P＜0.05)。與單獨(dú)IR組相比，VPA與IR聯(lián)合組

11、含53BP1焦點(diǎn)陽性細(xì)胞比率分別增加2.1倍和3.2倍(P＜0.05)。
　　2.VPA增加骨肉瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性
　　與正常組比較，單獨(dú)VPA組的細(xì)胞存活率明顯下降;與單獨(dú)IR組相比，0.5mM VPA與IR聯(lián)合組在2 Gy、4 Gy及6Gy各劑量下的細(xì)胞存活率均明顯降低(P＜0.05)，降低的比例分別為23.3％，32.4％及43.6％。
　　3.安全和臨界劑量VPA能夠抑制細(xì)胞HR修復(fù)通路
　　輻射后24

12、 h時(shí)，0.5 mM或1.0 mM VPA與IR聯(lián)合組含有γH2AX焦點(diǎn)細(xì)胞的陽性率顯著地高于單獨(dú)IR組的2.24倍和3.43倍(P＜0.05)，0.5 mM或1.0 mMVPA與IR聯(lián)合組含有53BP1焦點(diǎn)細(xì)胞的陽性率也顯著地高于單獨(dú)IR組的1.27倍和1.62倍(P＜0.05)。
　　輻射后6h，VPA與IR聯(lián)合組含有BRCA1焦點(diǎn)的細(xì)胞陽性百分比明顯低于單純IR組，降低的比例分別為26.5％(P＜0.05);輻射后24 h，

13、VPA與IR聯(lián)合組含有BRCA1焦點(diǎn)的細(xì)胞陽性百分比也低于單純IR組，為15.3％(P＞0.05)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果提示，0.5 mM VPA或者1.0 mM VPA與10μM ABT888聯(lián)合作用使細(xì)胞克隆形成率均顯著低于其他各組(P＜0.05)。
　　4.安全和臨界劑量VPA能夠抑制細(xì)胞NHEJ修復(fù)通路
　　與對(duì)照組相比，單獨(dú)0.5 mM或1.0 mM VPA處理組I-SceI誘導(dǎo)的NHEJ重組效率分別降低至63.8％(

14、P＜0.01)或61％(P＜0.01)，兩處理組之間無明顯差異(P＞0.05)。KU80蛋白表達(dá)水平在單獨(dú)VPA組和VPA與IR聯(lián)合處理組表現(xiàn)為顯著下降，但DNA-PKcs和KU70蛋白表達(dá)水平在各組細(xì)胞中無明顯變化。
　　5.安全劑量VPA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期無明顯影響
　　單獨(dú)0.5 mM或1.0 mM VPA處理組在G1、S與G2/M各期的細(xì)胞比率與對(duì)照組沒有顯著差異。
　　6.安全劑量VPA能夠增加骨肉瘤細(xì)胞

15、基因組不穩(wěn)定性
　　對(duì)于無VPA處理組，輻射處理前后細(xì)胞的染色單體與染色質(zhì)斷裂百分率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但是輻射狀異常染色體結(jié)構(gòu)形成的百分率由1.59％增加到7.34％(P＜0.05)。與單獨(dú)VPA處理組相比，VPA與IR聯(lián)合組的細(xì)胞染色單體斷裂的百分率由4.57％增加到17.24％(P＜0.05)、染色質(zhì)斷裂的百分率由18.27％增至到43.1％(P＜0.05)以及輻射狀異常染色體結(jié)構(gòu)形成的百分率也表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)

16、。
　　結(jié)論
　　1.應(yīng)答DNA損傷反應(yīng)時(shí)，安全劑量和安全臨界劑量下的VPA都可進(jìn)一步增加IR所致的DNA DSBs損傷在骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)的蓄積。
　　2.安全劑量下的VPA能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并且增加細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性。
　　3.安全劑量下的VPA增加骨肉瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性可能是通過干擾BRCA1介導(dǎo)的HR和KU80介導(dǎo)的NHEJ分子機(jī)制所致。
　　4.安全劑量下的VPA能夠增加骨肉瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性。