紫杉醇和吡柔比星對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞放射增敏作用的研究.pdf

1、目的:骨肉瘤是臨床中最常見的原發(fā)骨腫瘤，多發(fā)于青少年，惡性度高，早期易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，隨著化療劑量密度的提高，預(yù)后逐漸有所改善，5年生存率約為70％。傳統(tǒng)認(rèn)為骨肉瘤對(duì)放療不敏感，但隨著放射生物學(xué)認(rèn)識(shí)的深入，人們發(fā)現(xiàn)如果放射劑量足夠大，多種以往認(rèn)為不敏感的腫瘤仍可通過放療以取得良好的療效。近年來以圖像引導(dǎo)適形放療（IGRT）為主的精確放療的開展，給提高放射劑量帶來了希望。另外不可忽視的一點(diǎn)是更多放射增敏藥物的發(fā)現(xiàn)也明顯提高了放療的療效。紫杉醇

2、(paclitaxel，PTX)、吡柔比星(herarubicin，THP)均是骨肉瘤治療常用的化療藥物，具有將細(xì)胞阻滯在特定細(xì)胞周期的作用?；诖吮菊n題除了研究紫杉醇、吡柔比星對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG-63的生長(zhǎng)抑制作用，還重點(diǎn)對(duì)兩種藥物單用及聯(lián)合使用對(duì)MG-63細(xì)胞的放射增敏作用、及其與藥物作用時(shí)間的關(guān)系，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為臨床提供更多的理論依據(jù)。
　　方法:無菌實(shí)驗(yàn)室中將MG-63細(xì)胞置于37℃、飽和濕度5％CO2、

3、10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　1、光鏡觀察:將不同濃度的紫杉醇和吡柔比星作用于MG-63細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下定時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并照相。
　　2、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn):將細(xì)胞用胰酶消化后調(diào)整至3×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，加入不同濃度PTX(6、0.6、0.06、0.006、0.0006μg/ml)和THP(10、1、0.1、0.01、0.00

4、1μg/ml)，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后每孔加入新鮮配制的MTT再次孵育4h，棄去上清液，加入DMSO震蕩10min，于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度（測(cè)定波長(zhǎng)520nm）并計(jì)算IC10。
　　3、克隆形成實(shí)驗(yàn):細(xì)胞在各組藥物作用24h后給予不同劑量(0、2、4、6、8Gy)照射以及藥物作用不同時(shí)間(0、12、24、36h)后給予X線(4Gy)照射，10-14天后計(jì)數(shù)肉眼可見的細(xì)胞集落，計(jì)算出細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)(survivingfract

5、ion，SF)并擬合細(xì)胞生存曲線。根據(jù)擬合參數(shù)計(jì)算放射增敏比(sensitivityenhancementratio，SER)。并比較各組藥物作用于MG-63細(xì)胞不同時(shí)間后進(jìn)行照射細(xì)胞生存率的變化，確定最佳照射時(shí)間。
　　4、流式細(xì)胞技術(shù):將MG-63細(xì)胞隨機(jī)分為5組，對(duì)照組不加任何處理，單純照射組僅給予6GyX線照射，PTX+照射組、THP+照射組及兩藥聯(lián)合+照射組分別用藥物處理24h更換不含藥物的培養(yǎng)基并照射6Gy。以上五組共

6、同孵育24h，常規(guī)消化離心，棄上清，PBS清洗2遍，加入冰預(yù)冷的70％乙醇4℃固定過夜,離心去乙醇，PBS清洗2遍，取足量細(xì)胞直接PI染色，另取足量細(xì)胞分別加入不同鼠抗人抗體工作液(bcl-2、bax、caspase-3)及羊抗鼠FIFT-IgG二抗工作液，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和相關(guān)凋亡蛋白bcl-2、bax、caspase-3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、倒置相差顯微鏡下觀察可見經(jīng)PTX和THP作用的MG-

7、63細(xì)胞，開始以三角形、多邊形、梭形細(xì)胞為主，生長(zhǎng)良好。細(xì)胞隨時(shí)間的延長(zhǎng)及濃度的增加，梭形逐漸增多，最后變?yōu)閳A形。細(xì)胞貼壁能力逐漸減弱，漂浮細(xì)胞增多。細(xì)胞體積普遍變小，胞質(zhì)濃縮，胞膜不完整。最后部分細(xì)胞漂浮，部分貼壁細(xì)胞碎裂，其余貼壁細(xì)胞較對(duì)照組生長(zhǎng)明顯緩慢。
　　2、不同濃度紫杉醇、吡柔比星作用24h后，MG-63細(xì)胞抑制率逐漸增高(P＜0.05)，其藥物毒性呈濃度依賴性，IC10分別為0.01μg/ml和0.004μg/ml。

8、
　　3、紫杉醇、吡柔比星及兩藥聯(lián)合放射増敏比D0比分別1.14、1.49和0.97，Dq比分別為1.17、1.06和40.33，SF2比分別為1.08、1.04和1.61。IC10濃度各組藥物作用于MG-63細(xì)胞不同時(shí)間后再進(jìn)行照射，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低(P＜0.05)，二者呈正相關(guān)。12h后照射吡柔比星單藥組細(xì)胞存活最少，24h后照射兩藥聯(lián)合組細(xì)胞存活最少(P＜0.05)。
　　4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示紫杉醇、吡

9、柔比星單藥以及兩藥聯(lián)合作用于MG-63細(xì)胞后進(jìn)行射線照射均可使G2/M期細(xì)胞比例升高，細(xì)胞凋亡增多，相關(guān)凋亡蛋白(bcl-2、bax、caspase-3)表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，bcl-2/bax比值降低，兩藥聯(lián)合為著。
　　結(jié)論:
　　1、紫杉醇及吡柔比星對(duì)MG-63細(xì)胞均有明顯抑制作用，抑制效應(yīng)隨藥物濃度的增加而提高，顯示其藥物毒性呈濃度依賴性。
　　2、紫杉醇、吡柔比星單藥及聯(lián)合使用對(duì)MG-63細(xì)胞均有放射增敏