骨肉瘤組織硒含量測定及硒甲基硒代半胱氨酸誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究骨肉瘤組織中硒含量；研究硒甲基硒代半胱氨酸(MSC)對人骨肉瘤細(xì)胞系MG—63的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。 方法：收集8例骨肉瘤和10例非骨肉瘤的全血標(biāo)本及14例骨肉瘤組織和該患者自身正常骨組織，采用氫化物原子熒光光譜法測定血液和組織中硒元素含量；利用WST-1法檢測硒甲基硒代半胱氨酸(MSC)單獨(dú)及聯(lián)合鹽酸吡柔比星對MG—63細(xì)胞的增殖抑制作用。倒置顯微鏡下觀察MSC對MG—63細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響。Hoechst3334

2、2/PI雙染在熒光顯微鏡下觀察MG—63細(xì)胞在不同濃度的MSC作用下凋亡的形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞儀檢測MSC對MG—63的細(xì)胞周期的影響。酶標(biāo)法檢測凋亡執(zhí)行蛋白Caspase—3的活性。Western—blot檢測凋亡抑制蛋白Bc1-2表達(dá)。 結(jié)果：①骨肉瘤組織中的硒含量為(0.082643±0.033587) mg/Kg，同一患者正常骨組織的硒含量為(0.033571±0.018131) mg/Kg，兩者比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

3、P<0.01)。②骨肉瘤患者全血中的硒含量為(0.09475±0.027855) mg/L，非骨肉瘤組全血的硒含量為(0.0822±0.035543) mg/L，兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。③在不同濃度MSC(6.25μ mol/L，12.5μ mol/L,25μ mol/L，50μ mol/L，75μmol/L，100μ mol/L)作用48h后，WST-1法檢測MG—63細(xì)胞的生長抑制率分別為(54.33±2.07)％,(

4、60.79±2.25)％,(59.76±4.81)％,(58.82±7.25)％，(65.58±4.11)％，(69.07±0.14)％，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示MSC對MG—63細(xì)胞生長抑制呈濃度依賴性。④用50μmol/LMSC處理MG—63細(xì)胞12h、48h、96h后，WST-1法檢測生長抑制率分別為(24.04±0.50)％，(58，82±7.25)％，(84.90±3.90)％，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示MSC對MG—63細(xì)胞生長抑

5、制呈時(shí)間依賴性。⑤倒置顯微鏡下觀察：MSC作用后，MG—63細(xì)胞變圓，細(xì)胞間距逐漸增大，變圓的細(xì)胞數(shù)量增多，可見到大部分細(xì)胞凋亡特征性的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞皺縮，核固縮碎裂并有凋亡小體形成。50umol/L MSC處理MG—63細(xì)胞48h后，Hoechst/PI雙染，熒光顯微鏡下觀察到藍(lán)染細(xì)胞增加明顯而紅染細(xì)胞增加不明顯，呈低紅高藍(lán)，為凋亡的細(xì)胞圖像。⑥流式細(xì)胞儀檢測：MG—63細(xì)胞經(jīng)50μ mol/L MSC處理48小時(shí)后，在周期圖上G0

6、期出現(xiàn)明顯的亞二倍峰；72小時(shí)后亞二倍峰變寬，結(jié)果顯示MSC能誘導(dǎo)MG—63細(xì)胞凋亡。50μ mol/L MSC處理48h、72h后處于的G0/G1期細(xì)胞分別為72.50％和92.0％，S期為23.6％和3.8％，G2/M期為5.8％和1.2％。處于G0/G1期的細(xì)胞所占比例增加，而處于S期、G2/M期的細(xì)胞所占比例減少，提示MG—63細(xì)胞被阻斷在G0/G1期。⑦0、50μ mol/L、100μ mol/L MSC處理MG—63細(xì)胞24

7、h后酶標(biāo)法檢測Caspase—3活性分別為(2.26±0.04)、(3.46±0.40)、(3.88±0.28)。與對照組相比，50μ mol/L、100μ mol/L MSC處理后，MG—63細(xì)胞的Caspase—3活性分別增加了(53.8％±3.23)％，(72.9±2.03)％，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑧單獨(dú)使用鹽酸吡柔比星(THP)15μ g/ml處理48h后，WST-1法檢測MG—63的細(xì)胞生長抑制率為(16.68±5.39)％。M

8、SC50μ mol/L預(yù)處理細(xì)胞24h，換液后用THP15μ g/ml再處理24h，WST-1法檢測MG—63細(xì)胞的抑制率為(80.41±3.51)％，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示MSC與THP聯(lián)合作用較THP單獨(dú)對MG—63的抑制作用更為明顯。 結(jié)論：⑴骨肉瘤組織中硒含量明顯高于自身正常骨組織，提示骨肉瘤的發(fā)生可能與硒含量有關(guān)。⑵硒甲基硒代半胱氨酸對骨肉瘤細(xì)胞系MG—63具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，并且呈時(shí)間和劑量依賴，其機(jī)制可能為