紫杉醇和吡柔比星治療骨肉瘤的分子機制的研究.pdf

1、目的：骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于10～20歲的青少年，惡性程度高，預(yù)后差，手術(shù)和化療在臨床治療骨肉瘤提高患者生存期中發(fā)揮著重要和關(guān)鍵的作用[2]。但是，在骨肉瘤復發(fā)患者的化療中發(fā)現(xiàn)存在高的失敗率和較低的中位生存率。研究骨肉瘤化療機制對骨肉瘤的治療和提高病人的生存率是非常必要的。吡柔比星已臨床用于治療骨肉瘤，而紫杉醇只作為治療骨肉瘤的二線用藥而且應(yīng)用不如吡柔比星。目前已有吡柔比星和紫杉醇在臨床上聯(lián)合應(yīng)用的報道。然而，很少有對

2、化療藥物誘導骨肉瘤細胞凋亡的分子機制的研究。因此，為了找到更加合理和有效的綜合治療方案，本實驗研究了吡柔比星和紫杉醇誘導凋亡活性的分子機制。
　　 方法：將MG.63細胞置于37℃，飽和濕度50％CO2的10％DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后期用于實驗。
　　 1.光鏡觀察：將不同濃度的紫杉醇和吡柔比星作用于MG-63細胞，在倒置相差顯微鏡下定時觀察細胞的生長情況并照相。
　　 2.MTT實驗：調(diào)

3、整細胞濃度為5×104/ml，以每孔200ul培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，進入對數(shù)生長期后采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測不同濃度紫杉醇（10、102、103、104nmol/L）和吡柔比星（102、103、104、105nmol/L）對細胞的生長抑制作用。
　　 3.流式細胞儀檢測細胞周期：采用不同濃度的紫杉醇和吡柔比星作用MG-63觀察對照組（不含藥）和102nmol/L紫杉醇組和103nmol/L吡柔比星組作用時間分為12h、

4、24h、48h和72h后收集細胞。收集細胞1000r/min離心5min，調(diào)整濃度為5×106個，用PBS洗一次，離心去上清；加入冰預(yù)冷的70％的乙醇固定，4℃放置1h，離心后去固定液，用3mlPBS重懸5min后1000r/min離心5min，棄上清；加入碘化丙鍵（Prooidium Iodide，PI：50mg/L Trinton X-1001.0％）室溫避光染色30min，用Epics-XLⅡ型流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期分布

5、，應(yīng)用軟件進行分析。
　　 4.Western印跡法觀察紫杉醇及吡柔比星作用后的人成骨肉瘤細胞：MG-63的PCNA、cyclinD1、cyclinE、Bcl-2、Bax的表達。
　　 結(jié)果：
　　 (1）倒黃相差顯微鏡下觀察可見經(jīng)102nmol/L紫杉醇處理：MG-63細胞12h后，細胞折光變強，部分細胞體積變小變圓，24h后細胞開始皺縮，貼壁能力差，細胞體積更小，少量細胞漂浮，48h后細胞體積普遍變小，胞質(zhì)濃

6、縮，大量細胞變圓漂浮，72h后大部分細胞變圓，失去增殖能力漂浮于液體中，出現(xiàn)明顯的藥物抑制現(xiàn)象。103nmol/L吡柔比星作用12h后細胞增值數(shù)量減少，細胞體積增大胞膜破裂胞質(zhì)外溢，細胞壞死漂浮，24h后分裂期細胞少見，胞膜破裂細胞壞死，漂浮細胞增多，48h后大部分細胞形態(tài)不規(guī)則，體積增大，壞死漂浮，存活細胞顏色晦暗，生長停滯，72h后漂浮壞死細胞明顯增多。
　　 （2）不同濃度（10、102、103、104nmol/L）紫杉醇

7、和不同濃度（102、103、104、105nmol/L）吡柔比星作用于MG-63細胞12h、24、48、72h，MTT結(jié)果顯示紫杉醇和吡柔比星均能明顯抑制MG-63細胞增殖，并呈劑量和時間依賴性（p<0.01）。
　　 （3）FCM分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度（10、102、103、104nmol/L）紫杉醇處理細胞24h及相同濃度（102nmol/L）紫杉醇處理細胞12h、24h、48h、72h后，G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰，G2/M期

8、所占比例隨藥物濃度和時間增加呈上升趨勢，而G1期所占比例呈遞減趨勢。不同濃度（10、102、103、104、105nmol/L）吡柔比星處理細胞24h及相同濃度（103nmol/L）吡柔比星處理細胞12h、24h、48h、72h后未見明顯凋亡峰出現(xiàn)，S期所占比例隨藥物濃度和作用時間增加呈上升趨勢。
　　 （4） western-bloting結(jié)果：經(jīng)紫杉醇和吡柔比星處理過的骨肉瘤細胞與對照組相比均表現(xiàn)出PCNA、cyclinD、

9、cyclinE和Bcl-2蛋白表達抑制，Bax蛋白表達增強。
　　 結(jié)論：
　　 （1）紫杉醇和吡柔比星均對骨肉瘤細胞MG-63存在抑制細胞增殖作用且具有時間.劑量依賴關(guān)系。隨時間延長不同濃度吡柔比星對細胞的最終抑制作用是一致的。凋亡峰最高時的濃度可能是最適濃度。低濃度紫杉醇長時間和高濃度紫杉醇短時間對細胞抑制作用一致。濃度和時間不是很重要的選擇，凋亡峰最高的時間和濃度效果最佳。
　　 （2）紫杉醇對骨肉瘤細胞M

10、G-63顯示出G2/M阻滯作用，并且有一定的時間.劑量依賴性，使細胞周期受到阻滯，并進一步誘導其凋亡。吡柔比星在細胞增殖周期中阻斷細胞進入G2期，使細胞停滯于S期，抑制DNA合成干擾細胞分裂。在一定范圍內(nèi)存在時間-劑量依賴性且對劑量關(guān)系更密切。不同濃度紫杉醇作用骨肉瘤細胞后G0/G1期比例整體呈下降趨勢，表明紫杉醇對細胞增殖周期的G0/G1期存在阻斷作用，具體機制有待進一步研究。不同濃度吡柔比星作用骨肉瘤細胞后細胞G0/G1比例呈先下降

11、后上升趨勢，表明吡柔比星對骨肉瘤細胞增殖周期G0/G1期延緩作用。
　　 （3）如果S期過大時停藥可導致腫瘤細胞繼續(xù)分裂，且分裂很快，如果是G2/M期，停藥后細胞很快進入S期。細胞被阻滯于G0期是最有效的。濃度過低時未見明顯凋亡峰說明藥物只殺傷正常細胞達不到殺傷腫瘤細胞的目的。濃度過高時仍無明顯凋亡峰出現(xiàn)，表明濃度過高時凋亡較少且相對副作用較大。只有合適有效濃度時，即凋亡峰明顯時達到殺傷腫瘤細胞的目的。吡柔比星還可能通過破壞骨肉