水稻內(nèi)源木聚糖酶OSX基因的克隆、表達(dá)及其抑制劑RIXI抑制效應(yīng)的研究.pdf

1、木聚糖是谷物飼料中一種主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，限制了谷物飼料的充分利用。β-1，4-木聚糖酶(EC3.2.1.8)是降解木聚糖過(guò)程中最關(guān)鍵的水解酶。目前，關(guān)于木聚糖酶的研究主要集中在微生物木聚糖酶，而谷物內(nèi)源木聚糖酶研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，谷物飼料中普遍存在蛋白類木聚糖酶抑制劑，使木聚糖酶活性不能充分發(fā)揮，且同一種抑制劑對(duì)不同來(lái)源木聚糖酶作用強(qiáng)度不同。本研究首次從水稻中克隆并改造了木聚糖酶基因osx，使其在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)活性表達(dá)，同時(shí)選擇細(xì)菌、真

2、菌來(lái)源木聚糖酶，從體外及基因水平初步研究一種谷物木聚糖酶抑制劑RIXI對(duì)不同來(lái)源木聚糖酶抑制效應(yīng)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 將水稻(oryza sativa)基因組中預(yù)測(cè)得到的木聚糖酶基因相關(guān)序列與其他谷物內(nèi)源木聚糖酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到保守區(qū)片段。通過(guò)進(jìn)一步分析該保守區(qū)序列與眾多水稻內(nèi)源木聚糖酶預(yù)測(cè)序列的同源性，從中“釣取”潛在的木聚糖酶基因，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到一條開(kāi)放閱讀框(ORF)為1443

3、bp的基因osx，該基因序列與水稻木聚糖酶基因預(yù)測(cè)序列NM＿001061680相似性達(dá)99％，該序列編碼480個(gè)氨基酸，不存在信號(hào)肽；將osx與表達(dá)載體pET-28a(+)相連接構(gòu)建pET-28a(+)-osx，導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)，經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)8-10h，超聲破碎上清液經(jīng)SDS-PAGE分析檢測(cè)到約53.5kDa的特異性條帶，但未檢測(cè)到木聚糖酶活性；通過(guò)蛋白同源建模分析，去除OSX蛋白N端120個(gè)氨基酸，C端

4、40個(gè)氨基酸，剩余序列僅含“Glyco-hydro-10”結(jié)構(gòu)域(126-418aa)，經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)8-10h，超聲破碎上清液經(jīng)western-blot分析S-OSX蛋白約36.2kDa，木聚糖酶活性為11.5IU/ml。
　　 抑制劑RIXI對(duì)不同來(lái)源木聚糖酶抑制水平的研究包括兩個(gè)方面：DNS法體外檢測(cè)抑制活性與酵母雙雜交分析木聚糖酶抑制劑RIXI與木聚糖酶的互作效應(yīng)。體外檢測(cè)結(jié)果顯示，木聚糖酶S-OSX、TFX、B

5、SX及ANX粗酶液、純化酶液分別經(jīng)RIXI作用后，酶活分別降低3.0、5.2、38.7、66.9％和4.7、6.8、52.6、70.2％；基因水平檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相對(duì)，抑制劑RIXI與S-OSX、TFX、BSX及ANX相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度分別為0.3、0.97、5.7和35.9％。體外檢測(cè)和基因水平檢測(cè)結(jié)果均顯示抑制劑RIXI對(duì)真菌來(lái)源的ANX抑制強(qiáng)度最大，BSX次之，而對(duì)于TFX和水稻內(nèi)源木聚糖酶S-OSX幾乎沒(méi)有抑制作用，提示S-OS