全麻藥調(diào)控脊髓抑制性氨基酸受體機(jī)制及功能研究.pdf

1、全麻藥是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)差異較大的藥物，在臨床上使用已有150多年的歷史，然而至今我們對其作用機(jī)制仍知之甚少，一般認(rèn)為全麻藥主要是通過直接與蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮作用的。在過去的二十年中，人們先后觀察到近30種存在于神經(jīng)元膜上的離子通道受到臨床濃度全麻藥的調(diào)控。但是，要將離子通道和受體的功能變化與全麻藥的終端行為學(xué)效應(yīng)聯(lián)系起來，仍然是巨大的挑戰(zhàn)。低濃度巴比妥類全麻藥誘導(dǎo)的痛覺過敏(hyperalgesia)現(xiàn)象，40年前就已被Clutton-

2、Brock觀察到，但其機(jī)制一直不清楚。近年越來越多的研究結(jié)果提示，作為痛覺信號加工處理的初級中樞，脊髓至少在全麻的兩個(gè)終端行為學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用：對傷害性刺激的制動(immobility)和鎮(zhèn)痛(analgesia)。因此我們推測，巴比妥類全麻藥誘導(dǎo)痛覺過敏的解剖基礎(chǔ)也在脊鏈。另一方面，已有大量實(shí)驗(yàn)證明，在痛覺信號的加工和處理過程中，GABAA受體發(fā)揮著至關(guān)重要的作用；而另一種主要的抑制性受體－甘氨酸受體在痛覺調(diào)控中的作用并不清楚。

3、不久前，Ahmadi和Harvey等證實(shí)，炎癥情況下，中樞釋放的前列腺素E2主要是通過作用于分布在脊髓背角表層的α3亞型甘氨酸受體來發(fā)揮痛覺過敏效應(yīng)的。這說明甘氨酸受體，至少是甘氨酸受體的部分亞型也直接參與了痛覺和痛覺過敏的調(diào)控。此外，甘氨酸受體在全麻中的作用一直以來都未受到重視，原因是它們主要分布在脊髓和腦干，而以往人們認(rèn)為高位中樞才是全麻藥的主要作用靶點(diǎn)。 在本研究中，我們以硫噴妥鈉(thiopental)為靜脈全麻藥的代表

4、，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗、生物化學(xué)、分子生物學(xué)以及行為學(xué)等技術(shù)手段，深入分析其對脊髓背角神經(jīng)元甘氨酸和GABAA受體的調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步探討甘氨酸受體在巴比妥類全麻藥所致痛覺過敏中可能發(fā)揮的作用。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.硫噴妥鈉增強(qiáng)脊髓背角神經(jīng)元GABAA受體功能和GABA能抑制性突觸傳遞在急性分離的脊髓背角神經(jīng)元上，在-50mV的鉗制電壓下，高濃度的硫噴妥鈉直接激活氯離子通道，誘導(dǎo)內(nèi)向電流，激活電流的閾濃度大約為50μM。硫噴妥鈉誘

5、導(dǎo)的電流對GABAA受體阻斷劑bicuculline很敏感，但對甘氨酸受體阻斷劑strychnine不敏感。臨床相關(guān)濃度的硫噴妥鈉顯著增強(qiáng)非飽和濃度GABA誘導(dǎo)電流的幅度，并延長GABA誘導(dǎo)電流的脫敏和去活化時(shí)間常數(shù)。與此相反，較高濃度的硫噴妥鈉反而抑制GABA誘導(dǎo)電流的幅度，這可能是由于開放的通道被阻塞造成的(openchannelblocker)。另外，30μM的硫噴妥鈉延長GABA能微小抑制性突觸后電流(mIPSC)的時(shí)程。這些實(shí)

6、驗(yàn)結(jié)果提示硫噴妥鈉增強(qiáng)GABA能抑制性突觸傳遞。 2.硫噴妥鈉和戊巴比妥鈉通過不同的分子位點(diǎn)調(diào)控GABAA受體硫噴妥鈉和戊巴比妥鈉具有非常相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但它們的臨床效能卻相差很遠(yuǎn)，因此我們進(jìn)一步檢測了硫噴妥鈉和戊巴比妥鈉在GABAA受體上的相互作用。30μM的戊巴比妥鈉可明顯增強(qiáng)GABA誘導(dǎo)電流的幅度，但對硫噴妥鈉誘導(dǎo)的最大電流沒有影響。相似地，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的最大電流也不受低濃度硫噴妥鈉的調(diào)控。然而，300μM的戊巴比妥鈉和

7、200μM的硫噴妥鈉共同誘導(dǎo)的電流的幅度是它們各自誘導(dǎo)電流幅度的線性總和。另一方面，在最大增強(qiáng)GABA誘導(dǎo)電流效應(yīng)濃度的硫噴妥鈉存在的情況下，戊巴比妥鈉不再增強(qiáng)GABA誘導(dǎo)電流的幅度，反之亦然。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示硫噴妥鈉和戊巴比妥鈉可能通過結(jié)合于GABAA受體上的不同位點(diǎn)來發(fā)揮它們的“擬似GABA”效應(yīng)，但通過相同的位點(diǎn)來發(fā)揮它們的“GABAA受體調(diào)控”效應(yīng)。 3.硫噴妥鈉亞基依賴性抑制甘氨酸受體功能與痛覺過敏 在急性分離

8、的脊髓背角神經(jīng)元上，硫噴妥鈉抑制甘氨酸誘導(dǎo)電流的幅度，加快電流的脫敏，但減慢電流的去活化，洗脫共給的高濃度硫噴妥鈉(300μM)，出現(xiàn)明顯的尾電流。此外，甘氨酸受體的低親和力激動劑－牛磺酸誘導(dǎo)的電流也明顯被硫噴妥鈉抑制。在HEK293細(xì)胞上，硫噴妥鈉降低不同亞型的重組甘氨酸受體介導(dǎo)的電流的幅度，其中，對于α3亞型甘氨酸受體，即使硫噴妥鈉的濃度低至3μM也有明顯的抑制效應(yīng)。洗脫高濃度的硫噴妥鈉，類似于天然的甘氨酸受體上的尾電流僅出現(xiàn)在α2

9、亞型甘氨酸受體上，說明硫噴妥鈉調(diào)控甘氨酸受體具有明顯的亞基選擇性。硫噴妥鈉降低背角神經(jīng)元甘氨酸能mUPSC的時(shí)程和頻率。此外，脊髓鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)同時(shí)注射5微克硫噴妥鈉和100微克甘氨酸幾乎完全消除單獨(dú)注射5微克硫噴妥鈉誘導(dǎo)的痛覺過敏。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示甘氨酸能反應(yīng)參與了硫噴妥鈉誘導(dǎo)的痛覺過敏，α3亞型的甘氨酸受體可能發(fā)揮更大的作用。硫噴妥鈉發(fā)揮開放通道阻塞作用的位點(diǎn)可能主要位于α2亞型的甘氨酸受體上。 總結(jié)：硫噴妥鈉增強(qiáng)GAB