漢坦病毒致細胞融合分子機制的初步研究.pdf

1、研究背景和目的: 漢坦病毒(Hantavirus，HTVs)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，是一種分節(jié)段的負鏈RNA病毒。病毒基因組由小(S)，中(M)，大(L)三個片段組成，分別編碼病毒的核衣殼蛋白(NP)，包膜糖蛋白前體以及RNA依賴的RNA聚合酶。包膜糖蛋白前體以共翻譯后切割的方式產(chǎn)生G1和G2糖蛋白，并經(jīng)由N．連接的糖基化修飾。漢灘病毒的包膜糖蛋白上共有五個糖基化位點，其中四個位于G1上(N134，-235

2、，-347，-399)，另一個位于G2上(N928)。通常N-連接的寡糖鏈可以通過多種方式影響蛋白質的功能，包括促進蛋白的正確折疊，保持蛋白構象的穩(wěn)定性，防止蛋白酶的消化等。我國是漢坦病毒流行危害最嚴重的國家，全世界90﹪以上的腎綜合征出血熱(HFRS)的病例發(fā)生在我國。腎綜合征出血熱在我國主要是由漢灘病毒(HTNV)和漢城病毒(SEOV)兩型病毒引起的。因此我們選擇漢灘病毒A9株，84FLI株以及漢城病毒L99株作為研究對象。

3、 病毒的包膜與宿主細胞膜的融合是包膜病毒進入細胞的第一步。正是這一膜融合的過程導致病毒的蛋白和基因組RNA進入宿主細胞，從而開始病毒的感染周期。包膜病毒不僅可以介導病毒包膜與宿主細胞膜之間的融合而且還可以介導細胞一細胞間的融合。對其他包膜病毒的大量研究表明，這一膜融合的過程是由表達在細胞表面的病毒的包膜糖蛋白(或者稱為融合蛋白)所介導的。病毒的融合蛋白包含一個重要的結構區(qū)稱為融合肽(fusion peptide)，在融合過程中起著重要作

4、用。一般認為病毒介導的膜融合的過程包括下列階段：融合蛋白構象的改變、融合肽的暴露、融合肽插入胞體膜、過渡的中間體的形成并最終伴隨著能量的轉移將兩個膜拉向一起，從而完成病毒膜與宿主細胞膜的融合過程。 病毒的融合蛋白所介導的膜融合是病毒進入宿主細胞最重要的步驟，因此清楚的闡明這一過程將有助于新的藥物以及疫苗的產(chǎn)生，從而阻斷病毒的感染。在其它的包膜病毒中，利用分析病毒膜融合的過程已經(jīng)產(chǎn)生了針對病毒進入的新的治療策略。例如，防治HIV感

5、染的恩福韋得(enfuvirtide)就是在研究HIV gp41所介導的膜融合的基礎上研制出來的。此外，由于許多其它的包膜病毒利用同樣的機制進入宿主細胞，因此我們可以利用相似的治療策略來防治許多的病毒性疾病。作為包膜病毒的一種，漢坦病毒感染宿主細胞時，它的包膜也必須與宿主細胞膜融合，允許病毒的內(nèi)容物進入宿主細胞。盡管漢坦病毒在酸性環(huán)境下可以引起細胞．細胞間融合的現(xiàn)象已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了二十多年，但是關于它的融合活性位點的確切定位以及導致這一過程的

6、機制目前我們?nèi)匀恢跎佟Ｒ延械难芯勘砻鳚h坦病毒的包膜糖蛋白可能參與了這一過程。此外，最近有國外學者用蛋白質組學計算機分析的方法發(fā)現(xiàn)布尼亞病毒的G2糖蛋白與其它包膜病毒(甲病毒、黃病毒等)的融合蛋白在結構上非常相似，而且有一段內(nèi)在的結構區(qū)(在漢灘病毒位于氨基酸的第763-785位)在所有的布尼亞病毒的G2蛋白上都是保守的且有著相似的定位。因此推測G2蛋白可能是漢坦病毒的融合蛋白，而這段高度保守的結構區(qū)則可能是它的融合肽。盡管有上述研究進

7、展，但是這些假說都缺乏足夠的證據(jù)支持。在本研究中我們在分子水平上對漢坦病毒致細胞融合的機制進行了初步探討，對上述假說提供了直接的證據(jù)。 具體的實驗內(nèi)容分述如下： 第一部分：漢坦病毒具有融合活性的結構蛋白基因片段的初步確定在本部分實驗中我們利用真核表達載體分別將三株漢坦病毒(兩株漢灘病毒，一株漢城病毒)的核蛋白(NP)和糖蛋白(GPs)在’Vero E6細胞中進行了單獨表達以及共表達，然后進行了細胞融合實驗，結果證明漢坦病

8、毒M片段編碼的糖蛋白具有融合活性，能夠獨立的引起細胞融合。 結果： 1.間接免疫熒光實驗以及免疫沉淀實驗表明三株漢坦病毒的包膜糖蛋白及核蛋白都能在Vero E6細胞中表達。 2.流式細胞儀分析表明只有糖蛋白能夠定位于細胞表面，而核蛋白則不能被轉運于細胞表面。 3.在細胞融合實驗中，單獨表達糖蛋白的細胞中可以觀察到細胞融合，而單獨表達核蛋白的細胞中則未出現(xiàn)融合現(xiàn)象，且將糖蛋白與核蛋白共表達并不能增強融合的強

9、度。 4.在細胞融合抑制實驗中，只有糖蛋白的單抗能阻斷細胞融合，而核蛋白的單抗則對融合活動沒有明顯影響。 5.盡管融合強度有所差異，三株病毒都出現(xiàn)了相似的融合結果。 結論： 1.漢灘病毒M片段編碼的包膜糖蛋白可以獨立的介導細胞融合，這一過程不需要病毒的核衣殼蛋白以及RNA聚合酶的參與。 2.漢城病毒也表現(xiàn)出這一特征，因此這有可能是漢坦病毒屬共有的特征。第二部分：N-連接的糖基化在漢灘病毒糖蛋白致細

10、胞融合活動中的作用在本部分實驗中我們調(diào)查了漢灘病毒A9株包膜糖蛋白上的糖基化位點對融合活動的影響。結果發(fā)現(xiàn)G2上的N-連接的糖基化對于細胞融合是必不可少的?？紤]到該糖基化位點對維持G2蛋白的功能所起的重要作用我們認為很可能G2就是漢灘病毒的融合蛋白。 結果： 1．免疫沉淀的結果表明，糖蛋白變異體的分子量有明顯的漂移。在單突變的分子量大約減少了3000Da；雙突變則大約減少了6000 Da。這與此前的報道中丟失了一個或者兩

11、個寡糖鏈的糖蛋白的分子量相符。這些結果表明點突變確實導致了糖基化位點的破壞。 2．流式細胞儀分析表明，除了突變體N134A僅表達了G2并且沒有能轉運到細胞表面以外，其它的糖基化缺失的蛋白突變體都能夠在細胞表面表達。 3．在轉染突變體N134A的細胞中沒有發(fā)現(xiàn)細胞融合活動，其原因可能是沒有相關蛋白在細胞表面表達。 4．其它糖基化缺失的突變體中，G1上糖基化的缺失對細胞融合沒有影響，而G2上的N-連接的糖基化(N92

12、8)的缺失則導致融合活動的消失。 結論： G2上的N-連接的糖基化對于融合活動是必須的，而G1上糖基化的缺失則對融合活動沒有明顯影響?？紤]到N-連接的糖基化對于維持蛋白功能的重要作用，我們有理由認為G2很可能是漢灘病毒的融合蛋白。 第三部分：漢灘病毒包膜糖蛋白上融合肽的初步確定在本部分實驗中我們調(diào)查了漢灘病毒A9株G2蛋白上一段高度保守的結構區(qū)(氨基酸殘基763-785)在融合活動中的作用。結果我們發(fā)現(xiàn)此保守區(qū)與

13、膜融合密切相關，很可能是病毒的融合肽。 結果： 1．丙氨酸置換769位以及785位的天冬氨酸對細胞融合活動以及蛋白的細胞表面表達都沒有影響。 2．天冬氨酸置換767位和771位的脯氨酸以及絲氨酸置換780位的半胱氨酸導致G2糖蛋白的錯誤折疊，從而不能轉運到細胞表面，因此未能觀察到細胞融合。 3．天冬氨酸置換772位、774位、776位的甘氨酸以及絲氨酸置換765位、770位、777位的半胱氨酸可以完全阻斷細胞融合