牙鲆淋巴囊腫病毒黏附蛋白及受體蛋白的研究.pdf

1、魚類淋巴囊腫病(Lymphocystis disease，LCD)是一種世界范圍內(nèi)流行的病毒病，宿主遍及42科125種以上的海水、淡水和半咸水魚類。研究黏附蛋白與細(xì)胞受體以及兩者之間的相互作用是探討淋巴囊腫病毒(Lymphocystis diseasevirus，LCDV)感染機(jī)制和綜合防治淋巴囊腫病的一個有效途徑。本文利用牙鲆LCDV敏感細(xì)胞系一牙鲆鰓細(xì)胞系(Flounder gill cell line，F(xiàn)G)，建立了牙鲆LCDV中

2、和抗體的篩選體系，從制備的抗牙鲆LCDV單克隆抗體中，篩選出2株牙鲆LCDV中和單抗，并對病毒的黏附蛋白進(jìn)行初步確認(rèn)；利用病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)(VOPBA)鑒定出牙鲆LCDV靶器官及FG細(xì)胞的LCDV受體蛋白，研究分析了FG細(xì)胞的LCDV受體蛋白特性及其在病毒感染中的作用。具體結(jié)果如下： FG細(xì)胞的培養(yǎng)是本文研究的基礎(chǔ)，在本文所選擇的培養(yǎng)條件下(含10％胎牛血清的Eagle’s MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH7.4，溫度20℃)，F(xiàn)G細(xì)

3、胞生長迅速，狀態(tài)良好，細(xì)胞生長曲線顯示，細(xì)胞3-4d即可達(dá)到增殖頂峰，7d之內(nèi)均保持良好狀態(tài)。將粗提的牙鲆LCDV接種于FG細(xì)胞，1-2d后細(xì)胞即出現(xiàn)明顯的病變，半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)為22.88/40μL。細(xì)胞病變有兩種形式，一是細(xì)胞崩解、脫落形成明顯的空斑，二是細(xì)胞融合形成大量的合胞體。利用制備的抗牙鲆LCDV單克隆抗體，通過免疫熒光技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法，均可檢測到FG細(xì)胞內(nèi)增殖的牙鲆LCDV，進(jìn)一步證實(shí)FG細(xì)胞是牙

4、鲆LCDV的敏感細(xì)胞。另外免疫熒光檢測病毒對FG細(xì)胞的吸附發(fā)現(xiàn)，牙鲆LCDV可與FG細(xì)胞表面結(jié)合，說明FG細(xì)胞表面具有牙鲆LCDV的受體，為受體蛋白的研究提供理論依據(jù)。 本文利用FG細(xì)胞，以患LCD的牙鲆血清和通過免疫獲得的兔抗牙鲆LCDV血清為研究對象，通過微量細(xì)胞病變中和實(shí)驗(yàn)，建立了檢測牙鲆LCDV中和抗體的方法，且對中和實(shí)驗(yàn)的主要參數(shù)包括病毒與血清的孵育條件、病毒與血清的濃度設(shè)定以及判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行探討。結(jié)果顯示患病牙鲆血清以

5、及兔抗血清對牙鲆LCDV感染都具有明顯的中和作用，具有中和效果的血清最高稀釋度分別為1:64和1:160。 本文采用差速離心和密度梯度法分離提純了牙鲆LCDV，以此作為抗原，運(yùn)用單克隆抗體技術(shù)，通過免疫熒光抗體技術(shù)和斑點(diǎn)免疫印跡技術(shù)篩選，有限稀釋法克隆出9株分泌抗牙鲆LCDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)微量細(xì)胞.病變中和實(shí)驗(yàn)篩選，得到2株具有中和性的牙鲆LCDV單克隆抗體(3G3和1B2)。Western blotting結(jié)果顯示

6、，中和單抗3G3和1B2能特異性結(jié)合的病毒多肽分子量分別為38.2 kDa和32.9 kDa。 本文運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，檢測到牙鲆的鰓、表皮、腎、胃、腸是牙鲆LCDV的靶器官。提取了各靶器官蛋白，通過病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)(VOPBA)進(jìn)行受體蛋白的鑒定，結(jié)果如下：鰓組織蛋白中鑒定出1條分子量為37.6 kDa的受體蛋白帶；表皮組織蛋白中鑒定出1條分子量為56 kDa的受體蛋白帶；胃、腸和腎組織蛋白中均鑒定出1條分子量為27.8 k

7、Da的受體蛋白帶。 本文利用NP-40裂解和差速離心法，提取了FG細(xì)胞的膜蛋白，利用VOPBA鑒定出FG細(xì)胞膜上的1個牙鲆LCDV受體蛋白，其分子量大小為37.6kDa。采用電洗脫的方法提純了該受體蛋白，雙向電泳結(jié)果顯示此蛋白為單一多肽，其等電點(diǎn)在6.0左右。將該受體蛋白經(jīng)胰蛋白酶和高碘酸鈉作用后，發(fā)現(xiàn)病毒與受體蛋白的結(jié)合變?nèi)?，推測此受體蛋白可能為糖基化的蛋白受體。用該受體蛋白免疫Balb/c小鼠，制備其多抗，免疫熒光結(jié)果顯示，