牙鲆淋巴囊腫病自愈機(jī)制的研究.pdf

1、目前大規(guī)模高密度養(yǎng)殖造成的水環(huán)境污染，致使水產(chǎn)病害日趨嚴(yán)重，特別是病毒性疾病造成的損失更加驚人。淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)，屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)，是我國(guó)海水養(yǎng)殖魚中大規(guī)模暴發(fā)的首例病毒。已知至少有42科、125種以上的魚可被淋巴囊腫病毒感染，其中海水魚占30科。國(guó)外報(bào)道蝶鲆類發(fā)病較多，這些魚通常為經(jīng)濟(jì)魚種，淋巴囊腫病的流行給該產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。目前，對(duì)病毒性感

2、染疾病尚無(wú)特效藥物，在人類中通常是利用疫苗進(jìn)行預(yù)防接種或干擾病毒復(fù)制的藥物及抗生素對(duì)癥治療，而干擾病毒復(fù)制的藥物常常給宿主帶來(lái)危害。水產(chǎn)養(yǎng)殖者大多使用抗生素類藥，易造成抗生素藥物的積累、破壞生態(tài)平衡、誘變抗藥菌株、污染水體，還導(dǎo)致了我國(guó)水產(chǎn)品的出口受阻。 據(jù)觀察，淋巴囊腫病毒感染有自限性，即疾病存在自愈現(xiàn)象。牙鲆出現(xiàn)自愈的主要表現(xiàn)在體表無(wú)腫瘤，病毒檢測(cè)為陰性。牙鲆自愈現(xiàn)象與溫度有密切的關(guān)系，一般在14℃或低于14℃時(shí)，腫瘤增長(zhǎng)較

3、慢；隨水溫的升高，18℃左右，腫瘤生長(zhǎng)較快，發(fā)病情況嚴(yán)重；但水溫達(dá)到24以上，牙鲆身上的腫瘤脫落，病魚出現(xiàn)自愈。通常認(rèn)為，在低溫下，魚類的先天免疫成份的活性較大；在高溫下，魚類的適應(yīng)性免疫如淋巴細(xì)胞活性和抗體活性變高。魚類顯示出季節(jié)影響的對(duì)病原體的敏感性。這無(wú)論是對(duì)于病原體的流行，還是宿主的敏感性增加是非常重要的。關(guān)于淋巴囊腫病的自愈機(jī)理從未見研究報(bào)道，但如果搞清這一問(wèn)題、可能會(huì)給該病的防治提供思路。 細(xì)胞因子與病毒的清除有密切

4、關(guān)系，尤其是免疫相關(guān)因子，它們的表達(dá)可干擾病毒在體內(nèi)的復(fù)制、組裝和分泌，因此本論文以淋巴囊腫病的自愈機(jī)理為內(nèi)容，從機(jī)體抗病因子和功能基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，利用real-time PCR技術(shù)探討其免疫防御機(jī)理；同時(shí)，利用雙向電泳技術(shù)，對(duì)牙鲆在自愈過(guò)程中血清蛋白質(zhì)出現(xiàn)的變化，尋找差異表達(dá)的蛋白，為進(jìn)一步探索魚類淋巴囊腫病自愈的原因?qū)ふ乙罁?jù)。以期找到治愈疾病的關(guān)鍵因素，為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的疾病防治提供有價(jià)值的參考。 本論文的主要成果如下：

5、1.利用PCR技術(shù)，對(duì)自愈牙鲆的各組織進(jìn)行LCDV-cn的檢測(cè)，結(jié)果顯示自愈后的牙鲆在脾、腎、鰓、心臟、腸、肌肉、血液、表皮、體表粘液、卵巢、腦和肝臟中都不含有病毒。說(shuō)明自愈后牙鲆體內(nèi)沒有病毒。 2.組織病理切片顯示肝臟PAS染色結(jié)果，自愈組比患病細(xì)著色深，說(shuō)明患病牙鲆肝臟由于LCDV-cn的感染而受損，糖原合成功能降低。腫瘤的AB-PAS染色結(jié)果，可見腫瘤細(xì)胞外層呈現(xiàn)藍(lán)色、為酸性物質(zhì)。初步分化的幼稚腫瘤細(xì)胞中，核仁非常發(fā)達(dá)、在

6、某些細(xì)胞核中還出現(xiàn)了2-3個(gè)核仁，在某些細(xì)胞中核變成了啞鈴狀；腫瘤的AB-PAS染色結(jié)果目前還未見報(bào)道。 3.利用real-time PCR技術(shù)，試驗(yàn)溫度分別設(shè)置為14℃，18℃，22℃和26℃，對(duì)正常對(duì)照組和患病牙鲆組肝、脾、頭腎中IL-1，TNF，INFR，IL-8，IL-8R,Mx的表達(dá)研究結(jié)果表明：在肝臟中，實(shí)驗(yàn)組IL-1的表達(dá)隨溫度的升高而增加，22℃達(dá)到峰值，是標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的3.8倍，(P<0.05)；對(duì)照組在22℃表

7、達(dá)匕升，增高1.9倍；在脾、頭腎中，IL-1的表達(dá)隨溫度的升高而升高，在26℃達(dá)到峰值，分別為10.8和13.9倍(P<0.05)。肝、脾中的Mx的表達(dá)均隨溫度的升高明顯增加，26℃時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照相比，增加到31.1和26.5倍(P<0.05)；只有頭腎中在22℃達(dá)就達(dá)到峰值，為42.1倍；在對(duì)照組，隨溫度升高，Mx的表達(dá)雖有增加，但最高是腎臟在26℃的表達(dá)，增高僅為2.1倍。實(shí)驗(yàn)組肝臟TNF在22℃時(shí)表達(dá)最高，是標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的8.51倍(

8、P<0.05)；脾和頭腎中的表達(dá)，無(wú)論是對(duì)照組還是實(shí)驗(yàn)組，均隨溫度的升高表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)組的肝、脾和頭腎中，在22℃時(shí)，TNFR的表達(dá)者噠到最高，分別為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的22.1、4.87和21.55倍(P值均<0.05)。試驗(yàn)組肝臟和腎臟中IL-8在22℃表達(dá)量最高，分別為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的25.7和1.67倍(P<0.05)，而脾臟中IL-8在18℃即達(dá)到峰值，為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的3.31倍(P<0.05).對(duì)照組的脾、腎組與其他溫度相比，在18℃也達(dá)

9、到最大表達(dá)量(P<0.05)。試驗(yàn)組脾和頭腎中IL-8R的表達(dá)在26℃最高，為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的4.5和5.6倍，(P<0.05)，肝臟中的IL-8R的表達(dá)量在22℃時(shí)最大，為9.73倍(P<0.05)；對(duì)照組肝脾中的表達(dá)在22℃最高為2.5和4.1倍(P<0.05)，頭腎中在26℃最高，為2.6倍(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)顯示隨著水溫的升高，細(xì)胞因子在實(shí)驗(yàn)組的不同組織內(nèi)表達(dá)明顯升高，在對(duì)照組表達(dá)升高不是很明顯。由于這些細(xì)胞因子涉及到牙鲆的非

10、特異性免疫，它們表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明高溫下牙鲆的非特異性免疫力增強(qiáng)，也說(shuō)明，隨著水溫的升高，牙鲆清除病毒的能力增強(qiáng)，使其自愈成為可能。 4.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用real-tiIlle PCR技術(shù)檢測(cè)了MHCIα、MHCII α和TCR在疫苗接種后不同時(shí)間以及不同溫度下表達(dá)水平的變化。在肝臟中，MHCI α、MHCII α和TCR峰值分別在22℃，26℃，22℃，增高倍數(shù)分別為14.03，16.33，10.6倍；在脾臟中MHCIα、MHCII α

11、和TCR峰值分別在18℃，26℃，26℃，增高倍數(shù)分別為2.11，16.87，2.89倍；在頭腎中MHCLα、MHCIIα和TCR峰值分別在14℃，26℃，18℃，增高倍數(shù)分別為5.23，9.96，10.9倍。疫苗注射組，肝、脾、腎中MHCIα的表達(dá)第2天高于第8天；MHCIIα的表達(dá)則相反，第8天高于第2天；TCR的表達(dá)無(wú)顯著性差異。從結(jié)果我們可以看出，MHCIIα和TCR的表達(dá)是溫度依賴性的，隨著水溫的升高，表達(dá)量升高。MHCI的表

12、達(dá)峰值的溫度相對(duì)較低?？傮w上來(lái)說(shuō)，LCDV感染組MHCIα，MHCIIα，TCR在不同組織的表達(dá)量要高于健康組。說(shuō)明被感染的牙鲆處在-種較強(qiáng)的免疫應(yīng)答狀態(tài)。對(duì)于MHCIα和MHCIIα在疫苗免疫后出現(xiàn)的應(yīng)答不同，應(yīng)該是它們不同的激活途徑導(dǎo)致。目前普遍認(rèn)為MHCI類分子主要傳遞內(nèi)源I生抗原，而MHCII分子主要傳遞外源性抗原。但部分內(nèi)源性抗原也可以由MHCII類分子傳遞，部分外源性抗原也可以由MHCI類分子傳遞。可見MHCI、II類基因在

13、表達(dá)匕互相補(bǔ)充共同調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫活動(dòng)。所以，高溫使MHC和TCR的高表達(dá)，有利于促進(jìn)機(jī)體對(duì)病毒感染細(xì)胞的識(shí)別，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫，從而清除病毒。 5. 本實(shí)驗(yàn)利用雙向電泳技術(shù)，對(duì)自愈牙鲆和患病牙鲆血清中表達(dá)的差異蛋白進(jìn)行了鑒定。通過(guò)分析型上樣，結(jié)果顯示自愈組的蛋白點(diǎn)為328±30個(gè)點(diǎn)，患病組為315±21個(gè)點(diǎn)。自愈組有8個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)E調(diào)，新增3個(gè)蛋白點(diǎn)，一個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)；患病組新增兩個(gè)蛋白點(diǎn)。制備型凝膠自愈組和病魚組的血清蛋白