環(huán)境雌激素對牙鲆性腺分化的作用和機(jī)制的研究.pdf

1、隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境雌激素的污染進(jìn)一步加重，成為人類和野生動物健康的潛在危害因素，然而目前對它們影響性分化的確切作用機(jī)制仍不清楚。本研究通過一系列體內(nèi)外試驗(yàn)，研究環(huán)境雌激素對性分化的作用并探索其可能機(jī)制，在認(rèn)識它們的危害、揭示其確切機(jī)制、提高鑒定水平并最終預(yù)防其對健康的危害等方面有一定的理論意義和實(shí)際價(jià)值。本研究采用了實(shí)驗(yàn)動物牙鲆，它俗稱比目魚，是一類硬骨魚，具有和人類相似的XX/XY染色體雌雄性別決定機(jī)制。但當(dāng)遺傳學(xué)雌性幼魚(XX)被

2、喂養(yǎng)在27℃水溫中或經(jīng)口給予性甾體激素時，它們的表型會轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌?，表現(xiàn)為有明顯雄性特征的精巢。因此牙鲆為研究環(huán)境因素影響性分化的分子機(jī)制提供了一個新穎而有研究價(jià)值的實(shí)驗(yàn)動物。 為了研究環(huán)境雌激素對牙鲆性腺分化的干擾作用和機(jī)制，本研究利用這種遺傳學(xué)雌魚(XX)由飼養(yǎng)水溫決定性別的生物學(xué)特性，在幼魚孵化后第30天到第100天性分化敏感期內(nèi)，喂養(yǎng)于27℃表型雄性化水溫中，分別用壬基酚(p-nonylphenol，NP)或雙酚A(bis

3、phenol A，BPA)按100μg/g飼料分別喂養(yǎng)兩組幼魚；用三羥基異黃酮(genistein，GEN)10和100 μg/g飼料喂養(yǎng)另兩組幼魚，另設(shè)18℃、27℃水溫和雌二醇(E2，27℃)對照組。在第100天幼年期和第300天成年期時，分別對各組魚的樣本作性腺組織學(xué)檢查，以判斷魚的表型性別，計(jì)算雌雄比例；再通過原位雜交法和RT-PCR法分析第100天青年期魚的生殖腺中細(xì)胞色素P450芳香酶(P450arom)和苗勒氏管抑制物質(zhì)(

4、MIS)等與性分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，以探索環(huán)境雌激素的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，喂食NP，BPA或GEN可以誘導(dǎo)27℃雄性化水溫中的幼魚雌性化，NP 100μg/g飼料組成年雌性比例占30％，BPA 100μg/g飼料組成年雌性比例占57％，都顯著高于對照組(0％)；GEN 10和100μg/g飼料組成年雌性比例分別占47％和97％，也明顯高于其對照組(17％)；原位雜交分析顯示，牙鲆幼魚出生后第100天時，P450arom mRNA在

5、NP、BPA和GEN組的雌魚卵巢中有明顯表達(dá)，但在27℃對照組表型雄魚的精巢中不表達(dá)：而MIS mRNA在三組的雌魚卵巢中不表達(dá)，但在表型雄魚的精巢中能見到極其明顯的表達(dá)，RT-PCR實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了原位雜交的結(jié)果，說明三種環(huán)境雌激素干擾牙鲆性腺分化是通過提高P450arom和抑制MIS mRNA表達(dá)變化實(shí)現(xiàn)的。 為了進(jìn)一步確定雌激素和環(huán)境雌激素是否影響基因P450arom的轉(zhuǎn)錄水平，本次研究先嘗試用E2作為工具藥物、運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方

6、法，在幾種細(xì)胞株內(nèi)做P450arom-熒光素酶報(bào)告基因分析。結(jié)果顯示，P450arom轉(zhuǎn)錄活性能夠被E2顯著誘導(dǎo)，誘導(dǎo)途徑是E2與雌激素受體亞型ERα結(jié)合而發(fā)揮作用，但不是通過ERβ途徑；這一誘導(dǎo)作用只發(fā)生在人類卵巢粒層細(xì)胞狀腫瘤細(xì)胞株KGN細(xì)胞內(nèi)(一種能表達(dá)P450arom mRNA而生成類固醇的細(xì)胞株)，而不發(fā)生在不生成類固醇的Hepa-E1、COS-7和E293數(shù)種細(xì)胞株中。據(jù)此推測，雌激素類誘導(dǎo)P450arom轉(zhuǎn)錄活性可能是通過

7、存在于KGN細(xì)胞中某些特殊因子介導(dǎo)而間接作用的。最后，為探索另一重要基因MIS在牙鲆幼魚性腺分化過程中的作用，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)在18℃雌性化水溫中，將重組MIS喂食遺傳學(xué)雌性牙鲆幼苗，再檢測魚的性別比例和相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，喂食重組MIS后，可以誘導(dǎo)18℃水溫中部分幼魚的表型雄性化，同時用原位雜交檢測到變性的表型雄魚的生殖腺中P450arommRNA表達(dá)受到了抑制，提示MIS基因在魚的性腺中具有抑制P450arom mRNA表達(dá)的作用而