牙鲆促性腺激素釋放激素及其免疫影響的研究.pdf

1、促性腺激素釋放激素(GnRH)是下丘腦-垂體-性腺軸的關(guān)鍵信息分子，在脊椎動(dòng)物生殖神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控中特別是在刺激促性腺激素的合成和釋放方面具有至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，是神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間互相聯(lián)系的信使之一，魚類GnRH及其受體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能逐漸成為神經(jīng)內(nèi)分泌和生殖生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。牙鲆(Paralichthys olivaceus)，屬硬骨魚綱，鰈形目，鲆科(Bothidae)，是中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚類，關(guān)于牙鲆GnRH

2、及其受體的分子生殖內(nèi)分泌研究未見報(bào)道，了解牙鲆GnRH及其受體的類型、分布和作用，對(duì)闡明牙鲆神經(jīng)-生殖-內(nèi)分泌的相互調(diào)控具有有十分重要的意義。本論文的研究結(jié)果如下： (1)本文采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了GnRH和NPY在性成熟牙鲆組織內(nèi)的分布。表明：GnRH陽(yáng)性細(xì)胞分布于腦、垂體、胃、腸、卵巢等神經(jīng)、消化和生殖器官；NPY在延腦、大腦、卵巢中檢測(cè)到了陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞。 (2)采用RACE技術(shù)獲得牙鲆607 bp全長(zhǎng)cGn

3、RH-II cDNA，編碼95個(gè)氨基酸的前體肽。該cGnRH-Ⅱ前體肽包含有23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽、cGnRH-Ⅱ成熟十肽(QHWSHGwYPG)、一個(gè)3肽(Gly-Lys-Arg)加工位點(diǎn)和49個(gè)氨基酸殘基的促性腺激素釋放激素相關(guān)肽(GAP)。前體氨基酸序列同源性分析表明，牙鲆cGnRH-Ⅱ前體與條斑星鰈(barfin flounder)相似性最高為97.6％，其次是軍曹魚科、麗魚科和鯛科魚類；與哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物同源性較

4、低。RT-PCR檢測(cè)顯示，cGnRH-Ⅱ基因在牙鲆腎臟、腦、垂體、鰓和卵巢中表達(dá)；以腎臟中表達(dá)水平最高。 (3)克隆獲得了牙鲆395 bp全長(zhǎng)sbGnRH cDNA，編碼98個(gè)氨基酸的sbGnRH前體。該sbGnRH前體肽包含有26個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽、sGnRH成熟十肽(QHWSYGLSPG)、一個(gè)三肽(Gly-Lys-Arg)加工位點(diǎn)和59個(gè)氨基酸殘基組成的GAP。前體氨基酸序列同源性分析表明，牙鲆sbGnRH與條斑星鰈的

5、同源性最高為86.7‰RT-PCR檢測(cè)顯示，sbGnRH基因在牙鲆腦、胃、脾臟、眼、垂體、肌肉、腸、卵巢中皆有表達(dá)。 (4)利用3'-RACE技術(shù)克隆得到了牙鲆391 bp sGnRH cDNA 3'-末端片段序 列，該片段預(yù)測(cè)能編碼61個(gè)氨基酸殘基的不完全sGnRH前體肽，包含有sGnRH十肽的后4個(gè)氨基酸殘基“WLPG”、一個(gè)3肽(Gly-Lys—Arg)加工位點(diǎn)信號(hào)和54個(gè)氨基酸殘基的GAP。sGnRH 3’-

6、末端cDNA含有205 bp的3’-UTR。 (5)利用RACE和nest-PCR．結(jié)合技術(shù)克隆獲得了牙鲆1671 bp GnRH-R全長(zhǎng)cDNA序列，包含147 bp的5’-UTR、1248 bp ORF和276 bp的3’-LJTR，編碼415個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，牙鲆CmRH-R含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族A視紫質(zhì)樣(Rhodopsin-like)亞家族，具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體特征：包含1個(gè)胞外N．末

7、端尾巴、3個(gè)胞外loop、3個(gè)胞內(nèi)。loop、由ECLs和ICLs連接的7個(gè)跨膜α螺旋以及1個(gè)胞內(nèi)C-末端尾巴。GnRH受體進(jìn)行蛋白活性位點(diǎn)搜索發(fā)現(xiàn)，牙鲆GnRH受體具有多個(gè)糖基化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II(CK II)、磷酸激酶C(PKC)和磷酸激酶A(PKA)磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)于GnRH-R．的活性和偶聯(lián)反應(yīng)具有重要功能。RT-PCR檢測(cè)表明牙鲆GnRH-R mRNA在腦、睪丸、腎臟、眼睛和卵巢中均有較強(qiáng)的表達(dá)。 (6)本文

8、探討了GnRH類似物(GnRH-A．)對(duì)活體牙鲆垂體中GnRH-R、GtHα、GtHI-β、GtHII-β和GH中轉(zhuǎn)錄水平的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，GnRH-A能夠誘導(dǎo)牙鲆GnRH-R．、GtHα、GtHI-β、GtHII-β和GH mRNA表達(dá)水平的升高，分別在處理后6h、12h、36h、12h和12h達(dá)到高峰。 (7)采用離體培養(yǎng)和活體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，研究了CmRH-A對(duì)牙鲆淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃