斜帶石斑魚促性腺激素釋放激素基因的克隆及其表達研究.pdf

1、促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）是下丘腦分泌產生的神經激素，它和腦垂體促性腺激素分泌細胞的特異性受體結合后刺激促性腺激素（gonadotropin，GtH）的產生和釋放，對性腺發(fā)育成熟與生殖行為起十分重要的作用。本文利用同源克隆和RACE方法，首次克隆得到斜帶石斑魚三種GnRH基因全長cDNA序列；通過序列比對分析GnRH基因與部分硬骨魚類結構異同；通過進化樹分析GnRH基因與

2、其他脊椎動物的進化關系。使用RT—PCR技術分析GnRH基因在斜帶石斑魚組織分布情況；使用免疫組織化學定位sbGnRH分泌細胞在斜帶石斑魚下丘的分布。通過埋植17α—甲基睪酮（17α—MT）誘導斜帶石斑魚性逆轉，采用實時熒光定量PCR的方法，對埋植前后sbGnRHmRNA和sGnRHmRNA在下丘和垂體的變化表達差異進行分析。 主要研究結果如下： 1.克隆的斜帶石斑魚cGnRHⅡcDNA全長603bp，推導出cGnRHⅡ

3、cDNA前體由86個氨基酸組成，包括23個氨基酸組成的信號肽，10個氨基酸組成的十肽，50個氨基酸組成的聯合肽。克隆的sGnRHcDNA全長519bp，推導出sGnRHcDNA前體由91個氨基酸組成，包括23個氨基酸組成的信號肽，10個氨基酸組成的十肽，55個氨基酸組成的聯合肽。克隆sbGnRHcDNA全長432bp，推導出sbGnRHcDNA前體由95個氨基酸組成，包括22個氨基酸組成信號肽，10個氨基酸組成的十肽，60個氨基酸組成的

4、聯合肽。氨基酸序列比對表明，cGnRHⅡ保守性最高，sGnRH次之，sbGnRH保守性最低。進行進化樹分析表明，斜帶石斑魚的三種GnRH與條斑星鰈、舌齒鱸、金頭鯛、烏魚、大西洋絨須石首魚、紅擬石首魚、軍曹魚關系較近，特別是與尼羅羅非魚親緣關系最近，與人類的親緣關系較遠。 2.組織分布表明，凡與生殖調控有關的區(qū)域如嗅球、端腦、中腦、后腦、延腦、垂體和下丘腦、性腺等都有的sbGnRHmRNA表達，表明sbGnRH的表達區(qū)域與生殖控制

5、區(qū)域是一致的。免疫組織化學技術在下丘檢測到sbGnRH分泌細胞。cGnRHⅡmRNA只在中腦有表達，在其他腦區(qū)都沒有表達。sGnRHmRNA在嗅球、端腦、中腦、延腦表達量較高；下丘腦、垂體、后腦、卵巢、鰓、胃、腎、腸中有微弱表達。結合序列分析和進化樹分析，推測sbGnRH在斜帶石斑魚生殖系統(tǒng)中具有重要作用，而cGnRHⅡ和sGnRH不直接參與GtH合成與分泌的調控而是起神經遞質作用，間接參與生殖活動的調節(jié)。 3.利用MT埋植技術

6、，4周內成功誘導斜帶石斑魚完成性逆轉。實時熒光定量PCR表明，下丘腦中的sbGnRHmRNA的轉錄活性水平在性逆轉完全轉變成功能性雄性后達到最高峰。推測sbGnRH對于精子發(fā)生和維持雄性性行為起重要作用，但是對于卵巢的發(fā)育和退化并無重要作用。垂體中，sbGnRHmRNA在性逆轉間性時達到高峰，暗示可能性逆轉的啟動首先需要高水平的sbGnRH在垂體的表達，從而引起下游垂體GtH水平的升高。sGnRHmRNA在下丘腦和垂體中的表達量很低，且