條石鯛促性腺激素基因的克隆、表達和性類固醇激素分析.pdf

1、本文以人工培育的條石鯛（Oplegnathus fasciatus）為研究對象，運用組織學、同源性克隆和RACE克隆法、放射免疫測定（RIA）法等技術手段，對條石鯛卵巢各發(fā)育期特征、促性腺激素（Gonadotropin Hormone, GtH）和膜孕激素受體（membrane progestin receptor，mPRα） cDNA全長的克隆、在組織表達特性和卵巢發(fā)育不同時期的表達特性、血清中促性腺激素在繁殖周期中的變化規(guī)律等進行了

2、研究，為深入認識條石鯛生殖調控機制提供了理論支撐。本研究結果為全面揭示條石鯛生殖調控機制以及繁殖調控研究提供了豐富的基礎資料。相關結果如下：
　　1.條石鯛促性腺激素α（GtHα）亞基的克隆及其表達特性分析
　　采用同源性克隆和cDNA末端快速擴增（RACE）方法，從條石鯛(Oplegnathidae fasciatus)垂體中獲得了全長為897bp的GtHα cDNA序列，其中包含249bp的5’非編碼區(qū)、399bp的開放

3、閱讀框和249bp的3’非編碼區(qū)。其ORF編碼132個氨基酸，前38個氨基酸為信號肽。肽鏈中包括10個保守Cys殘基和2個N-糖基化位點，在第122和124Cys中間間隔了一個組氨酸（His），形成CXC型趨化因子的特征結構。此外，在3’端末端含有一個加尾信號 ATTAAA。其預測蛋白分子量為14.59KDa，預測等電點為8.41。氨基酸同源性和進化分析表明，條石鯛GtHα與鱸形目魚類的進化關系較近，與鱸魚的同源性最高為98％。實時熒光

4、定量PCR方法檢測發(fā)現，GtHα mRNA在腦、垂體、卵巢中的表達量較高，在心、肝臟、胃、腸、肌肉、幽門盲囊微量表達，在脾臟、頭腎、鰓、腎臟中不表達，其中在垂體中的表達量最高；周期表達表明，垂體中 GtHα mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達到最大值，卵巢中 GtHα mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅳ期達到最大值，而腦組織中 GtHαmRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達到最低值。
　　2.條石鯛促濾泡激素β（FSHβ）亞基的克隆及其表達特性分析
　　采

5、用同源性克隆和RACE方法從條石鯛(Oplegnathidae fasciatus)垂體中獲得了全長為554bp的FSHβ cDNA序列。其中開放閱讀框長363bp，編碼了含120個氨基酸的蛋白，其中前18個氨基酸為信號肽。肽鏈中含了12個保守的Cys殘基和一個N-糖基化位點（NIS），在第255和第257半胱氨酸中間間隔了一個谷氨酸，形成CXC型趨化因子的特征結構。此外，在3’端含有一個加尾信號AAATAA。其預測蛋白分子量為12.9

6、6KDa，預測等電點為6.05。氨基酸同源性和進化分析表明，條石鯛FSHβ與鱸形目魚類的進化關系較近，與花鱸的同源性最高為88%。實時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現，FSHβ mRNA在垂體、卵巢中的表達量較高，在腦、心、肝臟、脾臟、鰓、胃、腸、肌肉、幽門盲囊微量表達，在頭腎和腎臟中不表達，其中在垂體中的表達量最高；周期表達表明，垂體中FSHβ mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅳ期達到最大值，而卵巢和腦組織中FSHβmRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達到最低值。

7、
　　3.條石鯛促黃體激素β（LHβ）亞基的克隆及其表達特性分析
　　采用同源性克隆和RACE方法克隆了條石鯛(Oplegnathidae fasciatus) LHβcDNA序列，并分析了LHβmRNA在雌性條石鯛組織中的表達差異和卵巢發(fā)育不同時期卵巢、垂體、腦中表達水平變化。結果表明，條石鯛LHβ基因全長857bp，其中ORF為450bp，編碼了149個氨基酸，前24個氨基酸為信號肽，肽鏈中包含了12個保守的Cys殘基和

8、一個N-糖基化位點（NQT），在第4個Cys和第5個半Cys位點之間存在著硬骨魚類特異性的Cys-Ser-Gly-His（CSGH）區(qū)域。此外，在3’端含有一個加尾信號AATAAA。其預測的蛋白分子量為16.56KDa，理論等電點為5.52。氨基酸同源性和進化分析表明，條石鯛LHβ與鱸形目魚類的進化關系較近，與斜帶石斑魚的同源性最高為98%。
　　實時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現，LHβmRNA在垂體和卵巢中的表達量較高，在鰓、心臟

9、、脾臟、腎臟、肝臟、腦、胃、腸、肌肉、幽門盲囊微量表達，在頭腎中不表達，其中在垂體中的表達量最高；周期表達表明，垂體和卵巢中 LHβ mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達到最大值，而腦組織中LHβmRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達到最低值。
　　4.條石鯛膜孕激素受體（mPRα）的克隆及其表達特性分析
　　采用同源性克隆和RACE方法，從條石鯛(Oplegnathidae fasciatus)卵巢中獲得全長為1222bp的mPRα序列。其中開

10、放閱讀框為1060bp，編碼了含353個氨基酸的蛋白。前16個氨基酸為信號肽。成熟肽部分包含了13個保守的Cys殘基。其蛋白分子量為40.68KDa，理論等電點為7.08。氨基酸序列比較分析發(fā)現其結構中存在7個跨膜區(qū)域。系統(tǒng)進化分析表明，條石鯛mPRα與云紋犬牙石首魚的同源性最高為98%。實時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現mPRαmRNA在腦和卵巢中的表達量較高，腎臟、鰓、心臟、脾臟、、幽門盲囊、腎臟、肝臟、腦、胃、腸、肌肉中表達量較低，其

11、中在腦中的表達量最高。周期表達表明，垂體和腦中的mPRα mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅳ期達到最大值，而卵巢中的mPRαmRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達到最大值。
　　5.血清中促性腺激素在條石鯛卵巢發(fā)育不同時期的含量測定
　　利用125I標記的放射免疫測定（RIA）方法檢測了FSH和LH在條石鯛在卵巢發(fā)育不同時期血清中的含量變化。結果表明： FSH在在卵黃生成期時急劇上升，并達到最大值，在產卵期時其含量有所下降。LH在卵黃生成期時急劇上