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文檔簡介
1、該研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的人GnRH2基因mRNA序列以及轉(zhuǎn)運肽(transporter,TRS)基因核苷酸序列,借助Oligo4.1設(shè)計了一對寡核苷酸引物,以引物3'末端的短互補序列退火形成小段雙鏈,從而互為模板和引物,通過引導(dǎo)合成長達90bp的GnRH/TRS序列GnRH/TRS.其其克隆到pMD18-T載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pYC1,經(jīng)酶切鑒定篩選出陽性克隆pYC1,進一步的序列分析確認其中GnRH/TRS序列的正確性.pY
2、C1經(jīng)BamHI和EcoRI酶切得到GnRH/TRS片段,然后將此片段克隆到表達載體pGEX-6p-1上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pYC2.經(jīng)酶切鑒定篩選出陽性克隆pYC2,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(ED3)plyS實現(xiàn)原核表達.IPTG誘導(dǎo)后成功表達出與預(yù)期大小相符的約28ku的融合蛋白,光密度掃描表達產(chǎn)物進行初步定量,表達產(chǎn)物約占菌體總蛋白的33.3﹪.表達產(chǎn)物經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析純化后,得到了純度較高的GST-GnRH/TRS融合蛋白
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