利用桿狀病毒在昆蟲細胞內表達斜帶石斑魚促性腺激素及其生物活性研究.pdf

1、斜帶石斑魚(EPinephelus coioides)，屬鱸形目Pereiformes、鮨科Serranidae、石斑魚亞科Epinephelinae、石斑魚屬Epinephelus，主要分布在沿海近礁水域，為雌性先熟的雌雄同體魚類，是目前我國沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類。但目前對斜帶石斑魚生長發(fā)育及繁殖的內分泌調控機制缺乏深入系統(tǒng)的研究，石斑魚在養(yǎng)殖過程中人工繁殖及促生長問題尚未得到很好的解決。本文根據(jù)已知斜帶石斑魚促性腺激素cDN

2、A序列，利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)對斜帶石斑魚促性腺激素進行體外重組，并對重組斜帶石斑魚促性腺激素(gonadotropin Hormone，GTH)的生物活性進行研究，以期對魚類促性腺激素基因的結構與功能有進一步的了解，為開展魚類促性腺激素的生理作用及作用機制研究打下基礎，并為進一步研究石斑魚生長和繁殖的神經(jīng)內分泌調控機制提供理論依據(jù)。本研究的主要內容及結果如下： 1．采用RT-PCR法從斜帶石斑魚腦垂體克隆出促性腺激素

3、GTHα、GTHIβ和GTH IIβ亞基并構建了斜帶石斑魚促性腺激素單個亞基cDNA轉移質粒載體pFB-HT-A-GTH IIβ、pFB-l-GTH IIβ、pFB-HT-A-GTH Iβ、pFB-l-GTH Iβ、pFB-HT-A-GTHα、pFB-1-GTH α和雙亞基pFB-GTH I和pFB-GFH Ⅱ共8種重組桿狀病毒轉移載體。pFastBac質粒是一種氨芐青霉素抗性供體質粒，含有桿狀病毒特異性啟動子與慶大霉素乙酰轉移酶基因以

4、及兩個Tn7轉座位點，需要表達的外源基因在多角體蛋白啟動子作用下能夠轉染桿狀病毒穿梭載體。采用特異性引物的多對組合對多個克隆進行了PCR鑒定，均出現(xiàn)了與預期值相符合的帶。之后通過酶切以及DNA序列測定進行進一步鑒定。對四次PCR鑒定都為陽性的三個克隆進行多個組合的雙酶切鑒定，結果均符合預期的酶切圖譜；測序結果與GeneBank上登錄的一致，氨基酸序列正確，表明斜帶石斑魚促性腺激素重組桿狀病毒轉移載體構建成功。 2．對上述8種斜

5、帶石斑魚促性腺激素重組桿狀病毒轉移載體進行轉座反應，并得到相對應的桿狀病毒穿梭質粒載體(Bacmid)。Baemid是大腸桿菌DH10BAe的一個大質粒(136Kb)，含有Tn7靶位點mini-attTn7和卡那霉素抗性基因。重組的質粒轉染大腸桿菌DH10BAc感受態(tài)細胞時，在含有四環(huán)素抗性基因和轉座酶基因的助質粒的協(xié)助下，pFastBac質粒與Bacmid發(fā)生位點專一性轉座，之后通過藍白斑篩選轉化子，分離制備高純度Bacmid DNA

6、。對陽性克隆通過PCR驗證，實驗結果與預期值符合。Southern雜交中重組Bacmid DNA呈雜交陽性，說明轉座反應成功。 3．在Sf-9昆蟲細胞中表達重組了斜帶石斑魚促性腺激素。于28℃培養(yǎng)昆蟲細胞Sf-9至對數(shù)生長期，利用Cellfectin混合高純度Bacmid DNA共轉染昆蟲細胞Sf-9，獲得重組病毒。繼續(xù)感染昆蟲細胞2-3輪，可獲得高滴度重組病毒。以適量重組病毒感染昆蟲細胞Sf-9，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲細

7、胞Sf-9中表達相應的重組蛋白，其表達量隨時間增加而增強，存在時間梯度。SDS-PAGE、PAGE以及Western Blot分析鑒定重組蛋白表達正確。蛋白電泳分析結果表明重組蛋白表達量占細胞可溶性蛋白質的15％左右。 4．采用性腺靜態(tài)孵育，放射免疫測定方法檢測重組斜帶石斑魚促性腺激素的生理活性，結果表明重組蛋白對性類固醇激素(testosterone(T)、17β-estradiol(E<,2>))的分泌有明顯的促進作用。斜

8、帶石斑魚性腺組織碎片放于M199孵育液中預孵育18-24小時后，加入不同濃度的重組蛋白(0.5，2.5，5和10μg)和hCG(1，10，100和1 000 IU)，在孵育2,6,12和24小時取孵育液離心測定性類固醇激素(T、E<,2>)的含量。其中2.5μg GTHⅡ、GTH Ⅰ、GTH Ⅱβ、GTH Ⅰβ處理組在濃度上表現(xiàn)出效果最好，因此可以推定其為最佳濃度；在處理時間上，12作用效果依次為GTH Ⅰ、GTHⅡ、GTHⅠβ和GTH

9、Ⅱβ，而GTH。 5．利用在體實驗，腹腔注射不同濃度的重組斜帶石斑魚促GTHI、GTH IIβ、GTH Iβ(5×10<'-3>，5×10<'-2>和5×10<'-1>μg／bw·g))和hCG(0.1，1和10 I／bw'g)，18小時后尾靜脈取血4℃離心用于性類固醇激素(T、E<,2>)的測定，其中取腦垂體、下丘腦和性腺組織用于測定GnRH、P450aromA、P450aromB、GTH Iβ、GTH IIβ和GTHα

10、 mRNA水平。實驗結果表明，注射重組蛋白后，能夠促進斜 帶石斑魚血清中性類固醇激素(T、E<,2>)分泌增加，同時P450aromA、P450aromB、GTH Iβ、GTH IIβ和GTHα mRNA表達水平升高，而GnPd mRNA表達水平下降。 其中重組斜帶石斑魚GTH II、GTH I、GTH IIβ、GTH Iβ在促進性類固醇激素(T、E<,2>)分泌上隨著濃度的增加而增強，在相同濃度條件下，GTH I表現(xiàn)出的作用效果最