性逆轉(zhuǎn)石斑魚性腺差異表達(dá)基因的克隆鑒定及其表達(dá)研究.pdf

1、赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelus akaara)是名貴海水經(jīng)濟(jì)魚類,雌雄同體,雌性先熟,存在天然性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象.雌魚一般在6齡性逆轉(zhuǎn)為雄魚,因而雌雄親魚性成熟不同步,導(dǎo)致受精率較低,制約著石斑魚的人工大規(guī)模養(yǎng)殖.目前主要是用雄性激素來培育雄親魚,但激素的過多應(yīng)用有很多弊端,要想徹底擺脫激素誘導(dǎo)性轉(zhuǎn),只有闡明其性別逆轉(zhuǎn)的分子機(jī)制,才能進(jìn)行人工改良以達(dá)到性別控制.用甲睪酮片飼喂2~4齡赤點(diǎn)石斑魚,6周后90％以上的雌魚性逆轉(zhuǎn)為功能性雄魚.應(yīng)用

2、SMART技術(shù)構(gòu)建了石斑魚性反轉(zhuǎn)前、后性腺組織的SMART cDNA文庫.用抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建了性反轉(zhuǎn)雄魚性腺差異表達(dá)基因的差減cDNA文庫(正向差減文庫)和正常雌魚性腺差異表達(dá)基因的差減cDNA文庫(反向差減文庫).從差減cDNA庫中隨機(jī)挑取1200個(gè)克隆進(jìn)行了PCR篩選和斑點(diǎn)雜交篩選,得到120個(gè)差異表達(dá)cDNA片段.挑選71個(gè)cDNA克隆測(cè)序,將所測(cè)序列經(jīng)GenBank檢索,發(fā)現(xiàn)有51個(gè)cDNA片段序列無明顯的同源性

3、,20個(gè)片段與報(bào)道的基因有較高同源性.運(yùn)用抑制性差減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization,SSH),結(jié)合SMART cDNA合成和RACE-PCR方法,從性反轉(zhuǎn)雄魚性腺的差減cDNA文庫中克隆到了石斑魚一氧化氮合酶蛋白抑制劑基因(EPIN).該基因cDNA全長為499 bp,開放閱讀框長270 bp,編碼的蛋白質(zhì)由89個(gè)氨基酸組成,5′端非編碼區(qū)74 bp,3′端非編碼區(qū)155 bp,具有

4、脊椎動(dòng)物典型的ACCATG起始序列.在篩選性反轉(zhuǎn)雄魚性腺差減cDNA庫時(shí)檢出了石斑魚鈣調(diào)蛋白基因(ECaM),用RACE-PCR方法獲得了該基因的全長cDNA片段.該基因cDNA全長為582 bp,開放閱讀框長450 bp,編碼的蛋白質(zhì)由149個(gè)氨基酸組成,5′端非編碼區(qū)74 bp,3′端非編碼區(qū)58 bp.虛擬Northern雜交表明,ECaM在性反轉(zhuǎn)雄魚性腺中表達(dá),而在正常雌魚性腺中表達(dá)微弱.運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)考察了其在石斑

5、魚不同組織中的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示ECaM在腦、心、肝、脾、腎都有轉(zhuǎn)錄,在精巢和下丘腦中轉(zhuǎn)錄水平較高,而在肌肉中轉(zhuǎn)錄甚弱.性反轉(zhuǎn)不同時(shí)期性腺的半定量RT-PCR及Western雜交表明,性逆轉(zhuǎn)過程中性腺里ECaM的表達(dá)量上調(diào).本研究結(jié)果提示鈣調(diào)蛋白可能在赤點(diǎn)石斑魚性逆轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮著作用,ECaM可能是促使石斑魚由雌向雄轉(zhuǎn)變的重要功能基因之一.用PCR方法從赤點(diǎn)石斑魚下丘腦中克隆到Sox9基因的完全編碼區(qū),并研究其時(shí)空表達(dá)模式.S