雌激素加速創(chuàng)面愈合作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 觀察卵巢切除對(duì)大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合情況的影響，以及雌激素受體在大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合過(guò)程中的表達(dá)情況；進(jìn)而觀察雌激素受體在表皮干細(xì)胞表面的表達(dá)情況，研究雌激素對(duì)離體培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞增殖遷移活性的影響，探討雌激素及其受體在創(chuàng)面愈合過(guò)程中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 2月齡雌性wistar大鼠40只，隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組(10只)，去卵巢組(15只)和單純手術(shù)組（15

2、只）。8周后，在背部制成全層全損皮膚創(chuàng)傷愈合模型，分別于傷后1、3、7、14和21d取材。常規(guī)組織學(xué)觀察皮膚愈合過(guò)程，及記錄三組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面面積和傷腔容積，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率，以及免疫熒光觀察雌激素受體的表達(dá)情況。
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心法培養(yǎng)正常成人皮膚的表皮干細(xì)胞（hESCs），流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)第二代細(xì)胞整合素?1，CK10，CK14，CK19抗原表達(dá)以鑒定ESCs。實(shí)驗(yàn)分3組：(1):表皮干細(xì)胞專用培養(yǎng)基(

3、即Epilif培養(yǎng)基)中加入乙烯雌酚(Diethylstilbestrol)配成濃度為0.1nmol/l(雌激素組)；(2):表皮干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中加入雌激素受體拮抗劑雷洛西芬(Raloxifene hydrochloride)配成濃度為10nmol/l（雌激素受體阻斷劑組）；(3): 單純ESCs培養(yǎng)組（空白組）。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組的ER-?的抗原表達(dá)情況。在倒置顯微鏡下刮擦生長(zhǎng)融合成片的ESCs以制備寬度為100um的“離體的單

4、層表皮細(xì)胞損傷”模型。模型制備后24、48、72h，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每高倍視野越過(guò)創(chuàng)緣遷移到創(chuàng)面的ESCs細(xì)胞數(shù)，并用sigmaScan pro5軟件計(jì)算創(chuàng)面愈合率，用MTT法檢測(cè)表皮干細(xì)胞的增殖分化活性，判斷雌激素對(duì)ESCs分裂增殖活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的傷腔容積和創(chuàng)面愈合率，單純手術(shù)組和假手術(shù)組的傷腔容積明顯小于去卵巢組；單純手術(shù)組和假手術(shù)組的創(chuàng)面愈合率明顯大于去卵巢組（P＜0.

5、01），而單純手術(shù)組和假手術(shù)組之間無(wú)明顯差異。損傷早期（1-3天）ER-β表達(dá)逐漸加強(qiáng)，主要在真皮層，單純手術(shù)組和假手術(shù)組ER-β表達(dá)與去卵巢組相比無(wú)明顯差別；7天ER-β表達(dá)逐漸加強(qiáng)，主要表達(dá)在真皮層，表皮層可見(jiàn)部分表達(dá)；14天ER-β表達(dá)仍在較高的水平，尤其表皮層表達(dá)明顯，且7-14天單純手術(shù)組和假手術(shù)組ER-β表達(dá)與去卵巢組相比有明顯差別；21天ER-β有所減弱，但在表皮層及真皮血管中仍有較強(qiáng)表達(dá)。
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流式

6、細(xì)胞儀檢測(cè)第二代ESCs整合素?1，ck19，ck14和ck10抗原陽(yáng)性率(分別是96.63％，95.47％，94.27％，1.32％)。雌激素組、雌激素受體阻斷劑組和空白組的ER-?抗原陽(yáng)性表達(dá)率（66.43％，43.47％，54.27％）。雌激素組、雌激素受體阻斷劑組和空白組越過(guò)創(chuàng)緣進(jìn)入創(chuàng)面的細(xì)胞在傷后24小時(shí)分別（33.6±0.34），（8.5±0.75）和（11.4±0.45）個(gè)/高倍視野；48h分別有（67.5±0.24），（

7、27.5±0.35）和（38.5±0.45）個(gè)/高倍視野；72h分別有（117.5±0.35），（63.5±0.35）和（78.5±0.45）個(gè)/高倍視野。3組傷后72小時(shí)創(chuàng)面愈合率分別為（69.00±0.05）％，（35.00±0.05）％，（48.00±0.06）％。上述指標(biāo)雌激素組與空白組和雌激素受體阻斷劑組具有顯著差異（P＜0.01)，空白組與雌激素受體阻斷劑組比較，差異性顯著(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：