血竭促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用機(jī)理研究.pdf

1、本課題應(yīng)用兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面模型，觀測(cè)血竭對(duì)創(chuàng)面愈合的作用，并通過(guò)溶劑提取法將血竭中黃酮類化合物和萜類化合物等主要成份進(jìn)行初步分離，并將其作用于在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮主要作用的角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，探討血竭在愈合過(guò)程中再上皮化以及肉芽組織形成階段的作用。本課題的實(shí)驗(yàn)由以下四個(gè)部分組成： 1、血竭局部外用對(duì)兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面愈合的影響血竭用基質(zhì)稀釋為0.3、3、30及100mg/ml4種不同濃度，并以基質(zhì)作對(duì)照，作用于兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面，于創(chuàng)面形

2、成后3、6、9、12天進(jìn)行大體觀察及顯微測(cè)量，通過(guò)蘇木精-伊紅染色觀測(cè)創(chuàng)面愈合組織病理變化，天狼猩紅染色觀察創(chuàng)面愈合過(guò)程中Ⅰ、Ⅲ型膠原比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用藥組創(chuàng)面愈合速度快于對(duì)照組，兩者相比差異顯著(P＜0.01)。創(chuàng)面愈合第6天Ⅰ、Ⅲ型膠原比值大于對(duì)照組(P＜0.01)，而第15天Ⅰ、Ⅲ型膠原比例與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 2、血竭提取物的制備將血竭經(jīng)過(guò)氯仿、乙酸乙酯、乙醇依次回流提取分別得到血竭氯仿提取液、乙酸乙酯

3、提取液、乙醇提取液。經(jīng)水浴揮干溶劑，應(yīng)用二甲基亞砜助溶，流通蒸汽滅菌，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)液稀釋，用于后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。 3、血竭提取物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響將稀釋后血竭氯仿、乙酸乙酯、乙醇提取液加入培養(yǎng)液對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，噻唑藍(lán)法檢測(cè)不同血竭提取物在不同濃度以及不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響，并繪制最適濃度下細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。利用流式細(xì)胞儀分析最適濃度培養(yǎng)條件下角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。結(jié)果顯示血竭乙酸乙酯提取物在0.0625m

4、g/ml-0.5mg/ml濃度范圍內(nèi)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性，在0.5mg/ml濃度值時(shí)促進(jìn)增殖作用最顯著，此條件下處于S期的細(xì)胞，較對(duì)照組增加25.7％(P＜0.01)。 4、血竭提取物對(duì)成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響血竭氯仿、乙酸乙酯、乙醇提取液分別經(jīng)培養(yǎng)液稀釋，進(jìn)行成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，噻唑藍(lán)法檢測(cè)不同血竭提取物在不同濃度以及不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖的影響，并繪制最適濃度下細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。用流式細(xì)

5、胞儀分析最適濃度培養(yǎng)下成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。應(yīng)用放射免疫分析法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原含量。 結(jié)果顯示：血竭乙酸乙酯提取物在0.2mg/ml-2mg/ml濃度范圍內(nèi)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性，在2mg/ml濃度值時(shí)促進(jìn)作用最顯著，此條件下處于S期的細(xì)胞較對(duì)照組增加18.3％(P＜0.01)，而上清液中透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原分泌量較對(duì)照組均有下降(P＜0.01)。 綜上所述，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)血竭能夠提

6、高兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面愈合速度，改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量，具有顯著促進(jìn)缺血?jiǎng)?chuàng)面愈合的作用。血竭乙酸乙酯提取物在一定濃度范圍內(nèi)，顯著促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖，提示血竭具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合過(guò)程中再上皮化及肉芽組織形成的作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)血竭乙酸乙酯提取物在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的同時(shí)，還可減少透明質(zhì)酸和Ⅲ型前膠原的分泌，說(shuō)明血竭既具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用又可以抑制瘢痕的過(guò)度增生。本課題證明了血竭對(duì)缺血難愈性創(chuàng)面有促進(jìn)愈合的作用；通過(guò)將血竭依次回流提取，縮小了對(duì)血