雌激素對(duì)放射損傷血小板減少癥的救治作用及機(jī)制研究.pdf

1、隨著科技的發(fā)展，核能及其相關(guān)的技術(shù)在軍事、醫(yī)學(xué)、工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域得到了更加廣泛的應(yīng)用。然而，核能為我們的生活帶來便利的同時(shí)，也增加了由電離輻射引起放射損傷的潛在風(fēng)險(xiǎn)。尤其是核事故、核爆炸等情況下會(huì)產(chǎn)生大量的放射損傷傷員。此外，臨床上接受放射治療和骨髓移植的腫瘤患者也會(huì)受到一定程度的放射損傷。骨髓是放射損傷的主要靶器官。其中，放射損傷引起的血小板嚴(yán)重減少會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出血和感染，甚至死亡。不幸的是，目前臨床上血小板減少癥的治療藥物種類較少，而且

2、它們大多還存在著起效慢、副作用大、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。因此，尋找一種有效、安全的放射損傷血小板減少癥的預(yù)防和救治方法顯得至關(guān)重要。
　　血小板由骨髓中的巨核細(xì)胞產(chǎn)生，血小板生成過程主要包括造血干細(xì)胞定向分化為巨核祖細(xì)胞、巨核祖細(xì)胞大量擴(kuò)增并分化為成熟巨核細(xì)胞、成熟巨核細(xì)胞釋放血小板等多個(gè)階段。其中巨核細(xì)胞的分化成熟是血小板產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟。巨核細(xì)胞成熟首先進(jìn)行核內(nèi)有絲分裂以形成多倍體，然后巨核細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)胞質(zhì)成熟過程，即脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大量

3、合成并形成分界膜系統(tǒng)，最后巨核細(xì)胞向血管竇伸出血小板前體并向血液循環(huán)中釋放血小板。在體內(nèi)，調(diào)控血小板生成最重要的細(xì)胞因子是血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)。但是，我們及他人的研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)還有其他因子也參與了血小板生成的調(diào)控。
　　雌激素是哺乳動(dòng)物體內(nèi)非常重要的一種性激素，主要由卵巢產(chǎn)生和分泌，它在人體內(nèi)有著廣泛的生物學(xué)作用。多個(gè)研究報(bào)道，雌激素對(duì)造血系統(tǒng)也有影響作用。有趣的是，巨核細(xì)胞不但被證實(shí)自身能產(chǎn)生雌激素

4、，而且雌激素和巨核細(xì)胞生成和血小板生成有一定的聯(lián)系。大量的臨床數(shù)據(jù)表明人體血小板水平也存在性別差異，而且這種性別差異與體內(nèi)的雌激素水平有關(guān)。另外，大量的研究表明，雌激素不僅在體外能夠促進(jìn)巨核細(xì)胞分化及血小板前體形成，在體內(nèi)也可促進(jìn)血小板的產(chǎn)生，但是使用他莫昔芬或氟維司群抑制雌激素受體(estrogen receptor，ER)的激活則會(huì)抑制血小板的產(chǎn)生。這些研究表明雌激素參與了巨核細(xì)胞的生成和血小板的產(chǎn)生，但是雌激素作用于血小板生成的哪

5、一階段及其相關(guān)機(jī)制仍未完全闡明。
　　雌激素是一種類固醇激素，主要通過雌激素受體ERα和ERβ發(fā)揮作用。ERα和ERβ是一類核受體，未激活時(shí)，ER位于細(xì)胞膜上，與配體雌激素結(jié)合后激活，從而形成同源二聚體（ERα/ERα或ERβ/ERβ）或異源二聚體(ERα/ERβ)，然后由細(xì)胞膜移位到細(xì)胞核中，與靶基因啟動(dòng)子上游的雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element，ERE)結(jié)合而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)效

6、應(yīng)。ERα和ERβ在全身表現(xiàn)為明顯的組織特異性分布。ERα主要表達(dá)于性器官如卵巢、乳腺等，而ERβ主要表達(dá)于非性腺器官如骨髓、肺、結(jié)腸等。另外，ERα和ERβ在結(jié)構(gòu)及功能如配體識(shí)別和結(jié)合、受體激活、輔活化子或輔阻遏物的募集、靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)上也有明顯的差異。已有研究報(bào)道，巨核細(xì)胞均表達(dá)ERα和ERβ，但是，哪種受體在雌激素對(duì)巨核細(xì)胞的作用中發(fā)揮主要作用及其下游的靶分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有待證實(shí)。
　　另一方面，雌激素是一種經(jīng)典的抗放藥

7、物，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都被證實(shí)有輻射保護(hù)作用，無論照前給藥還是照后給藥都可以顯著提高存活率。同樣在放療病人照射前給予雌激素，可以減輕外周血白細(xì)胞下降的程度，但是雌激素能否用于預(yù)防和治療放射損傷血小板減少癥仍然缺乏相關(guān)的研究。
　　圍繞以上科學(xué)問題，本研究使用小鼠骨髓(bone marrow，BM) Sca1+細(xì)胞來源的原代巨核細(xì)胞、人臍帶血(cord blood，CB) CD34+細(xì)胞來源的原代巨核細(xì)胞、人巨核祖細(xì)胞株M07e細(xì)胞、人成

8、熟巨核細(xì)胞株Meg-01細(xì)胞及c-Mpl-/-和ERβ-/-敲除小鼠，首先利用正常的C57BL/6J小鼠建立亞致死量放射損傷血小板減少癥模型，并在照射前或照射后給予雌激素處理，觀察雌激素對(duì)血小板水平恢復(fù)的影響;再利用細(xì)胞活性分析、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡觀察和血常規(guī)檢測(cè)等技術(shù)分析雌激素對(duì)巨核細(xì)胞增殖、分化、多倍體形成、血小板前體形成及血小板產(chǎn)生的影響，以明確雌激素對(duì)血小板生成的調(diào)控作用及作用階段;最后，再利用weste

9、rn blot、RT-PCR、qRT-PCR、小干擾RNA(siRNA)基因敲低、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)等方法，對(duì)雌激素促血小板生成作用的分子機(jī)制進(jìn)行深入分析。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1、通過建立小鼠急性放射損傷模型發(fā)現(xiàn)，急性放射損傷可導(dǎo)致小鼠血小板水平快速降低，而放射前雌激素預(yù)處理或放射后雌激素干預(yù)均能有效加速放射后小鼠血小板水平的恢復(fù)，縮短放射后血小板低谷期的持續(xù)時(shí)間，并顯著提高受照后小鼠的生存

10、率。說明傳統(tǒng)抗輻射藥物不但可以預(yù)防放射損傷血小板減少癥，還對(duì)放射損傷血小板減少癥有一定的救治作用。
　　2、雌激素盡管不能促進(jìn)巨核祖細(xì)胞的增殖，但卻可以促進(jìn)巨核細(xì)胞的分化成熟、多倍體形成、血小板前體的形成和血小板的產(chǎn)生，并且可以促進(jìn)小鼠骨髓巨核細(xì)胞成熟分化，顯著升高外周血血小板水平，說明雌激素可以促進(jìn)巨核細(xì)胞晚期分化，從而促進(jìn)血小板的生成。
　　3、雌激素處理巨核細(xì)胞可以顯著激活巨核細(xì)胞的ERβ受體，而非ERa受體，阻斷或敲

11、低ERβ可以顯著抑制雌激素誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞分化成熟和多倍體形成，提示ERβ可能是雌激素促血小板生成作用的主要靶受體。
　　4、雌激素誘導(dǎo)巨核細(xì)胞ERβ激活后，在眾多巨核細(xì)胞重要調(diào)控分子中發(fā)現(xiàn)GATA1的表達(dá)顯著上調(diào)，而敲低ERβ幾乎完全抑制了雌激素誘導(dǎo)的GATA1表達(dá)上調(diào)，提示GATA1可能是雌激素下游效應(yīng)的主要靶分子。進(jìn)一步通過雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERβ可以和GATA1的啟動(dòng)子結(jié)合，可能的ERE

12、序列位于-1380至-1574;另外，敲低巨核細(xì)胞GATA1的表達(dá)后，雌激素誘導(dǎo)巨核細(xì)胞多倍體形成效應(yīng)消失。這些結(jié)果表明，GATA1是ERβ下游的靶分子，ERβ激活后可與GATA1啟動(dòng)子結(jié)合，從而誘導(dǎo)GATA1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)巨核細(xì)胞多倍體形成。
　　5、體外實(shí)驗(yàn)證明，雌激素還可誘導(dǎo)GATA1下游靶分子STAT1表達(dá)上調(diào)和活化增強(qiáng);敲低巨核細(xì)胞ERβ和GATA1的表達(dá)后，雌激素并不能誘導(dǎo)STAT1表達(dá)上調(diào)和活化增強(qiáng);另外，敲低S

13、TAT1的表達(dá)幾乎可以完全抑制雌激素促多倍體形成的作用，提示STAT1可能是GATA1作用的下游靶分子，介導(dǎo)了雌激素促巨核細(xì)胞多倍體形成的作用。
　　6、NF-E2是GAT1下游的一個(gè)靶分子，體外實(shí)驗(yàn)表明雌激素處理巨核細(xì)胞后可以誘導(dǎo)NF-E2的表達(dá)上調(diào)，而敲低GATA1則可完全抵消雌激素誘導(dǎo)的NF-E2表達(dá)上調(diào);另外，NF-E2是巨核細(xì)胞血小板前體形成和血小板產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)控分子，這些結(jié)果提示，NF-E2可能是GATA1作用的下游靶