Micro RNA在原發(fā)免疫性血小板減少癥發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、第一部分
　　 實驗背景與目的：
　　 原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是一種自身免疫性出血性疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜。目前認(rèn)為ITP的發(fā)病是一個多步驟，多細(xì)胞參與的過程。MicroRNA(miRNAs)是一類非編碼單鏈小分子RNA，它能夠通過特異性的堿基配對抑制靶mRNA翻譯或誘導(dǎo)剪切，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。MiRNAs的功能涉及多種生物學(xué)

2、過程，與細(xì)胞分化、器官形成、腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在免疫系統(tǒng)中扮演了重要作用，它參與免疫細(xì)胞的發(fā)育，同時能調(diào)節(jié)獲得性免疫和天然免疫反應(yīng)，因而miRNA參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和實驗性自身免疫性腦脊髓炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)生。鑒于miRNA在免疫細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答及其他自身免疫性疾病方面的研究成果，我們推測miRNAs在ITP發(fā)病中同樣發(fā)揮著重要的作用。因而為了闡明miRNAs在ITP發(fā)病中的作用，

3、我們開始了此項研究。
　　 方法：
　　 (1)收集24例ITP病人及20例正常對照外周血標(biāo)本，采用密度梯度離心的方法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)；
　　 (2)選取3例ITP病人及3倒正常對照，以他們的PBMCs為研究對象，采用microRNA芯片技術(shù)初步篩選差異表達(dá)的miRNAs；
　　 (3)采用Taqman實時定量PCR的方法對芯片結(jié)果進(jìn)行大樣本驗證；
　　 (4)采用Real-ti

4、me RCR的方法檢測miRNAs加工蛋白Dicer、Drosha、DGCR8和Ago2的mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 MiRNAs芯片結(jié)果顯示：有8個顯著上調(diào)的miRNAs和12個顯著下調(diào)的miRNAs。進(jìn)一步Taqman實時定量PCR的驗證結(jié)果顯示：miRNA-130a(p=0.008)，miR-409-3p(p=0.01)和miR-28-5p(p=0.048)在ITP患者PBMCs中明顯低表達(dá)，但尚未發(fā)現(xiàn)

5、表達(dá)上調(diào)的miRNAs。另外，miRNAs加工蛋白DGCR8在ITP病人PBMCs內(nèi)的表達(dá)明顯下調(diào)(p=0.045)，而Dicer、Drosha和Ago2的表達(dá)與正常對照相比無明顯差異。進(jìn)一步的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，這些miRNAs加工相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 MiR-130a，miR-409-3p和miR-28-5p在ITP病人PBMCs內(nèi)低表達(dá)，推測這種低表達(dá)可能是由于DGCR8表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致miR

6、NAs加工受損所造成。上述結(jié)果說明miRNAs可能參與ITP疾病的發(fā)生，但具體的作用機制還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　　 第二部分
　　 研究背景：
　　 原發(fā)免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic purpura，ITP)是一種以外周血血小板數(shù)量減少和皮膚粘膜出血為主要臨床表現(xiàn)的器官特異性自身免疫性疾病。根據(jù)microRNAs(miRNAs)在免疫細(xì)胞分化，免疫應(yīng)答和自身免疫性疾病等方

7、面的研究成果，我們推測miRNAs在ITP發(fā)病中起一定的作用。在前一部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)microRNA-130a(miR-130a)在ITP病人PBMCs內(nèi)低表達(dá)，說明它參與ITP疾病的發(fā)生。以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a是一個多效性miRNA，它能通過調(diào)節(jié)水通道蛋白4、雌激素受體α和MET原癌基因等靶基因參與肺癌、腦水腫等多種疾病的發(fā)生。然而，對于miR-130a在免疫系統(tǒng)中的作用尚不清楚。因而為了進(jìn)一步闡明miR-130a在ITP

8、發(fā)病機制中的作用，提出此研究。
　　 方法：
　　 (1)通過生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-130a的靶基因。
　　 (2)采用雙熒光報告體系及miRNAs與靶基因3’非翻譯區(qū)結(jié)合位點定位點突變的方法驗證生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果。
　　 (3)通過電穿孔的方法向ITP病人外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)內(nèi)轉(zhuǎn)染pre-miR-130a或anti-miR-130a，使其過表達(dá)或沉默miR-130a。
　　 (4

9、)通過ELISA方法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清或血漿中TGF-β1和IL-18的蛋白表達(dá)水平，同時用實時定量PCR的方法檢測TGF-β1和IL-18的mRNA表達(dá)水平。
　　 (5)用Taqman實時定量PCR的方法檢測與TGF-β1共培養(yǎng)的細(xì)胞中miR-130a的表達(dá)，觀察TGF-β1對miR-130a表達(dá)的影響。
　　 (6)對同一個ITP病人于入院及血小板穩(wěn)定后兩個時間點取樣，檢測PBMCs內(nèi)miR-130a的表達(dá)及血

10、漿中靶基因TGF-β1和IL-18的濃度。
　　 結(jié)果：
　　 通過生物信息學(xué)的方法和雙熒光報告載體的進(jìn)一步驗證，確定TGF-β1和IL-18為miR-130a的靶基因。之后轉(zhuǎn)染pre-miR-130a使其過表達(dá)之后，TGF-β1和IL-18 mRNA及蛋白的表達(dá)受到抑制(p均小于0．05)。反之，沉默miR-130a之后，TGF-β1和IL-18 mRNA及蛋白的表達(dá)水平上調(diào)(p均小于0.05)。同時，培養(yǎng)的PBMCs

11、內(nèi)加入外源性的TGF—β1能促進(jìn)miR-130a的表達(dá)(p=0．046)，說明它們之間存在相互調(diào)節(jié)的循環(huán)。進(jìn)一步對ITP病人于入院及血小板穩(wěn)定后兩個時間點取樣，檢測miR-130a及靶基因表達(dá)的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，隨著疾病的緩解，miR-130a(p=0.036)和TGF-β1(p=0．015)的表達(dá)上調(diào)，同時IL-18的表達(dá)下調(diào)(p=0．028)。
　　 結(jié)論：
　　 MiR-130a通過調(diào)節(jié)靶基因TGF-β1和IL-