dTMP活性肽的篩選及其對放射損傷小鼠血小板減少癥的救治作用研究.pdf

1、血小板由骨髓巨核細胞產(chǎn)生,不僅具有凝血、止血功能,而且還參與機體抗感染、血管及組織修復等重要病理生理過程。骨髓為輻射敏感器官,當人員暴露于電離輻射后,骨髓造血干細胞的增殖與分化活性受到抑制,從而引起體內(nèi)巨核細胞數(shù)量嚴重減少,導致外周血血小板水平低下,易發(fā)生惡性出血、感染甚至危及生命。此外,臨床上原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥也頗為常見,如特發(fā)性血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血以及惡性腫瘤化/放療等也可導致血小板減少癥的發(fā)生。促進巨核細胞增殖

2、分化,加速血小板的生成是提高外周血血小板水平、有效救治血小板減少癥的關鍵所在。然而,目前臨床上針對血小板減少癥的特效藥物和救治手段較為缺乏,并且還存在著毒副反應突出、治療費用高昂等諸多缺陷。所以,探尋高效促血小板生成藥物并對其作用機制進行深入研究具有重要意義。
　　促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO),又稱巨核細胞生長及發(fā)育因子(megakaryocyte growth and development facto

3、r, MGDF),共由332個氨基酸組成,能夠與巨核細胞表面相應的受體c-Mpl結(jié)合,從而刺激巨核系祖細胞/巨核細胞的增殖與成熟分化,并最終促進血小板的產(chǎn)生與釋放。TPO是目前已知的巨核細胞及血小板系統(tǒng)最主要、作用最強的細胞調(diào)節(jié)因子。但是,通過基因工程制備并經(jīng)聚乙二醇修飾的第一代巨核系生長因子類基因工程藥物(rhTPO和rhMGDF)因在臨床試驗過程中誘發(fā)機體產(chǎn)生針對TPO的中和性抗體,造成自身內(nèi)源性TPO活性受抑,從而導致血小板數(shù)量進

4、一步減少。因此,美國食品與藥品管理局(FDA)至今未批準rhTPO類藥物進入臨床。目前國外研究機構(gòu)已基本停止了對重組人TPO的藥用研發(fā),轉(zhuǎn)而探尋TPO類似物或其它模擬物。
　　Cwirla等學者于1997年運用噬菌體表面展示技術篩選到了一種與天然TPO生物學特性相似而又與TPO無序列同源性的短肽(僅由14個氨基酸構(gòu)成),命名為促血小板生成素模擬肽(Thrombopoietin mimetic peptide, TMP)。研究證實,

5、TMP與巨核細胞表面TPO受體(c-Mpl)具有較高的親和能力,可促進依賴TPO細胞株的增殖和分化,而且由于與天然TPO無相同氨基酸序列,所以不會誘導機體產(chǎn)生TPO中和性抗體。但是,由于其促血小板生成活性相對較弱,且在機體內(nèi)半衰期較短,導致其推廣應用受到極大限制。
　　研究發(fā)現(xiàn),TPO之所以具有突出的促巨核細胞增殖、分化和升血小板活性,是因為它能夠同時結(jié)合兩個配對的c-Mpl分子,而也只有當c-Mpl分子形成二聚體后才能激活胞內(nèi)有

6、關增殖、分化的信號通路。由于一個TMP單體肽只能結(jié)合一個c-Mpl分子,所以盡管其與c-Mpl分子具有較高的親和力,但是其促巨核細胞增殖、分化的活性并不突出。如果將兩條TMP單鏈連接形成TMP二聯(lián)體(dTMP),一個dTMP多肽則可以同時結(jié)合兩個配對的c-Mpl分子,從而顯著提高其促血小板生成活性。
　　有研究報道,促紅細胞生成素(Erythropoietin, EPO)的模擬肽 EMP1與同源肽EMP33均可與受體EPOR結(jié)合,

7、但是EMP33并不能激活EPOR下游的JAK-STAT信號通路,原因在于EMP1和EPOR的復合體與EMP33和EPOR的復合體的旋轉(zhuǎn)角度不同(相差約15度)。有研究提示兩個EMP1之間的連接肽可以調(diào)節(jié)兩個EMP1的角度,所以選擇合適的連接肽對于提高EMP1二聚體的活性至關重要。同理,兩個 TMP之間連接肽的選擇也會對dTMP與c-Mpl的結(jié)合及其促血小板生成活性產(chǎn)生顯著影響。
　　因此,為了尋找具有突出升血小板活性的dTMP線性

8、多肽,在本研究中我們首先設計并合成了一系列由不同連接肽將兩個 TMP頭尾串聯(lián)起來的 dTMP多肽,從長度及氨基酸組成兩個層面對連接肽進行篩選。然后,從激活細胞內(nèi)相關信號通路的角度探討dTMP優(yōu)選肽促巨核細胞增殖分化的作用機制,同時,結(jié)合分子動力學模擬及分子對接軟件對dTMP的三維結(jié)構(gòu)及其與受體c-Mpl的結(jié)合方式進行分析。最后,復制急性放射損傷小鼠血小板減少癥實驗動物模型,觀察dTMP優(yōu)選肽對放射損傷所致小鼠血小板減少的救治作用。所獲得

9、的主要研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1.連接肽長度對dTMP的促巨核細胞增殖活性具有顯著影響,其中由8個G(甘氨酸)作為連接肽的dTMP活性較為突出。
　　2.通過對連接肽的氨基酸組成進行調(diào)整,發(fā)現(xiàn)在連接肽結(jié)構(gòu)中加入脯氨酸(Proline, P)可顯著提升dTMP的促巨核細胞增殖活性。
　　3.通過兩輪篩選最終獲得與等摩爾 TPO具有相似活性的 dTMP優(yōu)選肽(命名為No.341多肽)。
　　4.小鼠骨髓原代巨核細胞

10、檢測結(jié)果顯示,經(jīng) No.341多肽刺激培養(yǎng)14天,小鼠Sca+-I細胞表面CD41/CD61(巨核細胞成熟標志物)的表達水平較IL-3對照組顯著增高(83.26±6.26％vs15.70±2.31%, P<0.01),進一步證實該TMP二聯(lián)肽具有顯著促巨核細胞成熟、分化的作用。
　　5. Western blot結(jié)果顯示,dTMP(No.341多肽)作用10min即可顯著上調(diào)M07e細胞內(nèi)JAK-STAT5及ERK1/2的磷酸化水

11、平。另一方面,給予JAK-STAT和ERK信號通路阻斷劑則可以顯著抑制 No.341多肽的促巨核細胞增殖作用,提示 dTMP生物活性的發(fā)揮與其能夠快速激活 STAT5和ERK1/2信號通路有關。
　　6.分子動力學模擬及分子對接分析結(jié)果表明,連接肽的長度和氨基酸組成可以顯著影響dTMP的空間構(gòu)象,包括兩條 TMP單鏈之間的角度、跨度以及活性位點的暴露等,并能決定 dTMP與 c-Mpl的分子對接方式,在一定程度上揭示了連接肽影響d