養(yǎng)殖牙鲆腫瘤抑制基因p53的克隆及與淋巴囊腫病關(guān)系的研究.pdf

1、p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，目前已克隆得到了多種魚類的p53基因序列，但牙鲆體內(nèi)的該基因未見報(bào)道。本文采用RACE技術(shù)克隆了牙鲆的cDNA全長(zhǎng)，表明該基因cDNA全長(zhǎng)1798bp，包括238bp的5’非編碼區(qū)∞TR_)、1095開放閱讀框(ORF)、TGA終止密碼子和432bp的3’非編碼區(qū)(UTR)。該p53基因編碼365個(gè)氨基酸，分子量約為40.9Kda，等電點(diǎn)為6.5。序列分析表明：牙鲆p53蛋白和青鯔、川鰈的p53蛋白同

2、源性較高，而與人、斑馬魚、雞、爪蟾、虹鱒的p53蛋白同源性較低。p53基因在魚類中分化程度較高，但本研究顯示牙鲆p53蛋白在結(jié)構(gòu)和序列上擁有p53蛋白的典型特征，如具有5個(gè)進(jìn)化上高度保守的氨基酸簇、酸性疏水的N-末端，親水帶電的C-末端和倒數(shù)第二位上可以磷酸化的絲氨酸殘基。本文采用RT-PCR法檢測(cè)了p53基因的組織表達(dá)，研究表明：p53基因在健康牙鲆被檢組織內(nèi)均有表達(dá)，患淋巴囊腫病的牙鲆p53基因組織表達(dá)特征同健康牙鲆相似。

3、本文利用PCR方法克隆了牙鲆p53基因DNA序列，結(jié)果顯示：該基因全長(zhǎng)5208bp，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，第一個(gè)外顯子不編碼氨基酸序列，p53蛋白5個(gè)高度保守區(qū)域由第2、4、5、7和8外顯子編碼。本文克隆獲得的牙鲆p53基因與人、鼠、斑馬魚和青鳉等的p53基因在結(jié)構(gòu)上相同，表明p53基因的結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上保守性較強(qiáng)。 在獲得牙鲆p53基因DNA序列的基礎(chǔ)上，本文利用PCR-RFLP方法檢測(cè)了牙鲆p53基因5-8外顯子限制

4、性酶切片段的多態(tài)性。結(jié)果表明：在第6外顯子上存在1個(gè)Bgl Ⅱ限制性酶切多態(tài)位點(diǎn)，被Bgl Ⅱ酶切開的基因型定為A、未被切開的定義為a。發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因型在健康和患病牙鲆中基因型分布頻率不同，即患病牙鲆的基因型是Aa，健康牙鲆的基因型是AA。因此，可以推測(cè)牙鲆p53基因第6外顯子Bgl Ⅱ限制性酶切位點(diǎn)的多態(tài)性可能與牙鲆患淋巴囊腫病的發(fā)生有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)在牙鲆p53基因5-8外顯子上存在大量多態(tài)性位點(diǎn)；在第5和第6內(nèi)含子上存在由部分序列插