抑制p53與MDM2結(jié)合的抗腫瘤多肽設計與靶向遞送.pdf

1、生物體內(nèi)蛋白質(zhì)之聞的相互作用在生命過程中起著至關(guān)重要的作靂。據(jù)此設計和制備抑制劑的策略,目前已在多種疾病的干預性治療中得到驗證。抑瘤蛋白p53及其負性調(diào)節(jié)蛋白MDM2之間的相互作用與眾多腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。通過抑制p53與MDM2的結(jié)合,可恢復p53抑瘤活性而達到抗腫瘤效果。據(jù)保守估計,至少25％的腫瘤患者有望經(jīng)此類策略治療而受益,因此p53-MDM2抑制劑具有成為今后主要抗腫瘤藥物的潛力。P53-MDM2抑制劑主要分為小分子化合物

2、和多肽兩大類,其中多肽與小分子化合物相比,具有高親合力和高選擇性。但目前針對p53-MDM2的多肽抑制劑研究僅停留在分子水平,主要原因在于:
　　1)生理環(huán)境下多肽穩(wěn)定性差,易被酶降解而喪失活性;
　　2)靶點位于細胞內(nèi),一般多肽不具備入胞能力,無法實現(xiàn)其藥效。
　　為此,我們以此作為切入點,設計和制備穩(wěn)定性好、對p53-MDM2抑制能力強的多肽,并采用主動靶向遞藥策略,實現(xiàn)腫瘤細胞內(nèi)的多肽遞送,發(fā)揮其抗腫瘤作用。本論

3、文分為兩大部分介紹。
　　第一部分主要開展了抑制p53與MDM2結(jié)合的多肽設計、制備和表征。采用蛋白“嫁接”策略,以能夠與MDM2蛋白特異性結(jié)合的序列為模擬對象,選用具有三維結(jié)構(gòu)的微型蛋白毒素為模板,通過關(guān)鍵位點的“嫁接”,以期得到穩(wěn)定性好、對p53-MDM2抑制能力強的多肽。
　　首先,以天然p53序列為模擬對象,以蝎毒毒素BmBKTx1為模板,將p53上結(jié)合MDM2的關(guān)鍵位點“嫁接”到蝎毒微型蛋白上,經(jīng)分子水平表征,設計

4、產(chǎn)物stoppin-1能特異性結(jié)合MDM2,具有抑制p53與MDM2結(jié)合的能力;借鑒陽離子穿膜肽入胞原理,設計具有穿膜斃力的微型蛋白stoppin-2,經(jīng)細胞水平表征,stoppin-2可通過抑制p53與MDM2結(jié)合而選擇性殺傷腫瘤細胞;穩(wěn)定性實驗顯示,與直鏈短肽(17-28)p53相比,stoppin-2在近似生理環(huán)境下的穩(wěn)定性大大增強。結(jié)果提示,以微型蛋白毒素為模板設計p53-MDM2多肽抑制劑的策略是可行的。
　　其次,開展

5、了p53-MDM2多肽抑制劑的優(yōu)化設計,選用具有更強MDM2結(jié)合能力的PMI序列為模擬對象,以結(jié)構(gòu)更簡潔、制備更容易的蜂毒明肽apamin為模板,通過丙氨酸掃描和端基截取技術(shù)獲取PMI的關(guān)鍵位點和區(qū)域信息,進行蛋白“嫁接”優(yōu)化,獲得抑制p53與MDM2結(jié)合的微型蛋白stingin。表征結(jié)果表明,stingin結(jié)合MDM2能力強(Kd=17nM),具有制備容易、產(chǎn)率高、應用前景好的特點。
　　最后,根據(jù)鏡像噬菌體展示技術(shù)篩選結(jié)果,制

6、得了全D型的p53-MDM2多肽抑制劑D-PMIot并進行了表征。D-PMIα結(jié)合MDM2的能力(Ka=200nM)盡管低于stingin,但因其分子全部由D型氨基酸構(gòu)成,其穩(wěn)定性大幅提高,具有深入研究價值。
　　第二部分主要開展了p53-MDM2多肽抑制劑的腫瘤細胞靶向遞送和抗腫瘤藥效研究。選用能與腫瘤細胞表面整合素αvβ3特異性結(jié)合的RGD序列多肽,并修飾于脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)表面,將p53-MDM2多肽抑制劑遞送至體內(nèi)外腫瘤細胞內(nèi)

7、,以期發(fā)揮其抗腫瘤效果,提升多肽的應用價值。
　　首先,制備了功能性脂質(zhì)膜材料c(RGDDYK)-PEG3400-DSPE,采用逆向蒸發(fā)法構(gòu)建了包載stingin-5(L型多肽)和D-PMIα(D型多肽)的c(RGDKYK)-脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)。結(jié)果表明,c(RGDDYK)-脂質(zhì)體能有效包載多肽,該脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)平均粒徑為70～90nm,包封率約30％,可用于后續(xù)藥物遞送研究。
　　其次,以人腦膠質(zhì)瘤U87為模型,對多肽經(jīng)遞送入

8、胞后的體內(nèi)外抗腫瘤活性進行評價。細胞水平試驗結(jié)果表明,stingin-5抑制腫瘤細胞生長活性(IC50≈4.5μM)與陽性對照Nutlin-3(IC50≈4.0μM)相當,D-Pmta(IC50≈1.91μM)明顯強于Nutlin-3,提示c(RGDDYK)-脂質(zhì)體能有效遞送多肽入胞并發(fā)揮其抗腫瘤活性,D型多肽D-PMIa綜合抑制腫瘤生長效果好于L型。以U87皮下移植瘤和腦部原位腫瘤為模型,選用D型多肽D-PMIα進行體內(nèi)靶向遞送藥效評

9、價。結(jié)果表明,c(RGDDYK)-脂質(zhì)體-D-PMIα能顯著抑制皮下移植瘤生長、延長腦部原位腫瘤裸小鼠的生存時間。細胞和體內(nèi)水平均驗證了多肽通過抑制p53與MDM2結(jié)合、釋放p53蛋白而發(fā)揮抗腫瘤作用。結(jié)果提示,通過主動靶向給藥策略,可解決p53-MDM2多肽抻制劑在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤藥效問題。
　　最后,在上述研究工作基礎上,以D-PMIα經(jīng)優(yōu)化得到的的D-PMIβ為研究對象,在多肽N端修飾脂肪酸以提高其脂溶性,采用薄膜水化法構(gòu)建了

10、包載該多肽的c(RGDDYK)-脂質(zhì)體,并進行了體內(nèi)外藥效評價和作用機制探討。結(jié)果表明,多肽脂肪酸化后有利于脂質(zhì)體包載,且載藥量離、穩(wěn)定性好、制備工藝簡單,體內(nèi)外抗腫瘤藥效良好,具有較好的應用前景。
　　綜上所述,本文通過多學科的研究手段,設計和制備了抗腫瘤多肽,尤其是D型多肽,解決了多肽藥物穩(wěn)定性問題、提高了其抑制p53與MDM2結(jié)合的活性;借助主動靶向遞送策略,解決了該類多肽進入細胞的問題,使其在體內(nèi)外表現(xiàn)出良好的抗腫瘤藥效和