牙鲆淋巴囊腫病毒細(xì)胞受體的鑒定與特性分析.pdf

1、魚(yú)類淋巴囊腫病(lymphocystis disease，LCD)是由淋巴囊腫病毒(lymphocystisdisease virus，LCDV)引起的一種典型的皮膚和淺表組織慢性病毒性疾病，已知可感染至少42科140種以上的海水、半咸水和淡水魚(yú)類，尤其在我國(guó)養(yǎng)殖的牙鲆中流行較為廣泛。有報(bào)道表明淋巴囊腫病毒可能通過(guò)細(xì)胞吞噬和受體介導(dǎo)作用進(jìn)入宿主細(xì)胞。通過(guò)封閉細(xì)胞受體從而阻斷病毒入侵是防治病毒病的一個(gè)有效途徑。因此，本文旨在通過(guò)分離鑒定牙

2、鲆淋巴囊腫病毒受體，促進(jìn)對(duì)淋巴囊腫病毒侵染機(jī)制及其在宿主體內(nèi)傳播途徑的認(rèn)識(shí)，將對(duì)防治淋巴囊腫病有重要意義。
　　 本文利用免疫共沉淀技術(shù)和病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)(VOPBA)對(duì)牙鲆淋巴囊腫病毒的細(xì)胞受體進(jìn)行分離與鑒定，并用雙向電泳、質(zhì)譜分析及生化方法等對(duì)受體蛋白的特性進(jìn)行分析；制備了病毒受體的單克隆抗體；通過(guò)病毒阻斷實(shí)驗(yàn)確定了淋巴囊腫病毒的細(xì)胞受體，并利用所制備的受體單抗研究了病毒受體蛋白在牙鲆各組織中的分布情況。具體結(jié)果如下：<

3、br>　　 (1)LCDV及其敏感細(xì)胞系牙鲆鰓細(xì)胞(Flounder gill cell line，F(xiàn)G)是本文研究LCDV細(xì)胞受體的兩大關(guān)鍵材料。通過(guò)差速離心和蔗糖密度梯度離心得到了LCDV病毒粒子，形態(tài)完整，純度較高；FG細(xì)胞用含10％胎牛血清的Eagle’s MEM培養(yǎng)基在22℃、2％CO2條件下培養(yǎng)，生長(zhǎng)迅速，狀態(tài)良好。高純度的LCDV與生長(zhǎng)良好的FG細(xì)胞為后續(xù)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 (2)首先利用NP-40和差速

4、離心抽提出FG細(xì)胞膜蛋白，并通過(guò)免疫共沉淀法用抗LCDV單克隆抗體和LCDV從FG細(xì)胞膜蛋白中沉淀下一個(gè)分子量為27.8 kDa的LCDV受體蛋白。對(duì)該受體蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果表明27.8kDa受體蛋白與β-actin蛋白有較強(qiáng)的相關(guān)性；利用切膠回收方法提純?cè)撌荏w蛋白，制備了其多抗，Western blotting顯示該多抗主要與FG細(xì)胞膜蛋白中的27.8kDa蛋白結(jié)合，但也與42.7kDa蛋白微弱結(jié)合；用抗β-actin抗體與FG細(xì)

5、胞膜蛋白反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其中42.7 kDa蛋白有較強(qiáng)反應(yīng)，而27.8 kDa蛋白有較弱反應(yīng)。因β-actin在不同的物種間高度保守，其分子量大小為42-43 kDa左右，故推測(cè)27.8 kDa蛋白可能是β-actin蛋白的一部分或是一種與β-actin蛋白有某些相似結(jié)構(gòu)域的未知蛋白。
　　 (3)利用提純的27.8 kDa受體蛋白免疫Balb/c小鼠，采用單克隆抗體技術(shù)經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆等，得到了2株單克隆抗體(2G11和3D9

6、)。Westernblotting分析顯示這2株單抗均可與FG細(xì)胞膜上的27.8 kDa蛋白結(jié)合，且與其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。利用2株單抗進(jìn)行共聚焦免疫熒光和膠體金免疫電鏡研究，結(jié)果顯示FG細(xì)胞上與單抗特異性結(jié)合的陽(yáng)性信號(hào)主要分布在細(xì)胞膜表面，呈點(diǎn)狀或線狀不連續(xù)分布，證實(shí)27.8 kDa蛋白主要位于細(xì)胞膜上。阻斷EHSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單抗2G11和3D9均可部分阻斷LCDV與FG細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合，阻斷率分別為83.6％和79.4％；病毒體外感染阻

7、斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單抗2G11和3D9可以有效阻斷LCDV對(duì)FG細(xì)胞的感染。
　　 (4)采用非變性VOPBA在FG細(xì)胞上分離出135 kDa受體蛋白，經(jīng)SDS-PAGE與雙向電泳發(fā)現(xiàn)135 kDa蛋白由58.3 kDa、44.6 kDa及37.6 kDa三個(gè)蛋白組成，其中起病毒結(jié)合活性為37.6 kDa蛋白。采用免疫共沉淀聯(lián)合VOPBA的方法分析27.8 kDa和37.6 kDa蛋白的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在免疫共沉淀中，雖然僅出現(xiàn)27

8、.8kDa蛋白，未出現(xiàn)37.6kDa蛋白，但在用免疫共沉淀結(jié)果進(jìn)行VOPBA時(shí)顯示出了37.6kDa蛋白，但未出現(xiàn)27.8kDa蛋白，說(shuō)明FG細(xì)胞膜上的27.8kDa蛋白與37.6kDa蛋白均為L(zhǎng)CDV的受體蛋白，其中27.8kDa蛋白僅在天然狀態(tài)下具有病毒結(jié)合能力，且在細(xì)胞內(nèi)含量較高；而37.6kDa蛋白的病毒結(jié)合能力與其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)，但其在細(xì)胞內(nèi)含量較低。
　　 (5)利用免疫共沉淀方法對(duì)牙鲆鰓、胃、腸和表皮組織上的L

9、CDV受體蛋白進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)牙鲆鰓、胃與腸組織蛋白中均有一個(gè)分子量為27.8 kDa的蛋白能與LCDV特異結(jié)合，而表皮中LCDV結(jié)合蛋白分子量為37.6 kDa。通過(guò)能夠特異性顯示糖蛋白的阿爾新藍(lán)染色法對(duì)該免疫共沉淀結(jié)果進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)鰓、胃與腸中的27.8 kDa蛋白為非糖蛋白，而表皮中的37.6 kDa蛋白為糖蛋白。用Western blotting分析抗27.8 kDa蛋白單抗與牙鲆各組織蛋白的結(jié)合情況，結(jié)果顯示該單抗可與牙鲆鰓、胃