牙鲆kiss2及其受體gpr54-2基因的分子鑒定及表達分析.pdf

1、牙鲆（Paralichthys olivaceus）是一種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類，雌性個體的生長速度明顯快于雄性個體，因而關(guān)于牙鲆性別分化及生殖調(diào)控的研究成為目前研究的熱點。Kisspeptin/Gpr54系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及其鑒定是神經(jīng)內(nèi)分泌學的一項重大突破，也是脊椎動物生殖研究領(lǐng)域的一場新革命。目前關(guān)于Kisspeptin系統(tǒng)的研究主要集中在哺乳類動物，在魚類中的研究僅僅處于起步階段，而在牙鲆中仍未見報道。因此，本研究克隆了牙鲆kiss2及

2、其受體gpr54-2基因，檢測了二者在牙鲆早期發(fā)育階段及成體各組織的表達情況；運用western-blot和免疫組化方法檢測了Gpr54-2蛋白在牙鲆腦、性腺和肝臟組織中的表達情況，以期為進一步闡明kiss2基因在牙鲆生殖中的作用提供基礎(chǔ)。其主要結(jié)果如下：
　　1牙鲆kiss2及其受體gpr54-2基因的分子鑒定
　　從牙鲆腦組織中克隆得到牙鲆kiss2及其受體gpr54-2基因cDNA序列。其中獲得的牙鲆kiss2cDNA

3、長度為449 bp，該序列包括一段83 bp的3'非翻譯區(qū)和一段編碼121個氨基酸殘基的366 bp開放閱讀框；牙鲆gpr54-2 cDNA全長為2556bp，該序列包括1143bp的開放閱讀框，899bp的5'非翻譯區(qū)（UTR）及504bp的3'非翻譯區(qū)，編碼380個氨基酸。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，牙鲆Kisspeptin與脊椎動物Kisspeptin-2聚為一支；牙鲆Gpr54-2魚類Gpr54-2聚為一支。氨基酸相似性分析表明，牙

4、鲆Kisspeptin2與條紋鱸（Morone saxatilis）、羅非魚（Oreochromis niloticus）、塞內(nèi)加爾鰨（Solea senegalensis）及斑馬魚（Danio rerio）Kisspeptin2的同源性分別為76％、74%、69%和28%。牙鲆Gpr54-2與大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossus）、塞內(nèi)加爾鰨（Solea senegalensis）及斑馬魚（Danio rer

5、io）的Gpr54-2的同源性分別為98%、93%和88%。
　　2 kiss2及gpr54-2在牙鲆成體各組織的表達分布
　　采用實時熒光定量PCR檢測了kiss2及其受體gpr54-2基因在牙鲆成體各組織的表達分布情況。其中牙鲆kiss2基因在腦中的表達量最高，在肝、鰓、腸和卵巢中次之，在肌肉、精巢和心臟中的表達量較低，而在胃和腎中沒有檢測到 kiss2基因的表達。而 gpr54-2基因在所檢測的牙鲆組織包括腦、肌肉、心

6、臟、鰓、腎、胃、肝臟、腸、性腺中都有表達，但表達量差異很大。其中g(shù)pr54-2在牙鲆腦組織中的表達量最高，其次是性腺組織，且在卵巢的表達量稍高于精巢，而在其它組織中的表達量則相對較低。kiss2及其受體 gpr54-2在牙鲆腦中的豐富表達及在精卵巢中的較高表達表明二者很有可能與牙鲆神經(jīng)系統(tǒng)和生殖發(fā)育相關(guān)。
　　3 kiss2及gpr54-2在牙鲆早期不同發(fā)育階段的表達圖式
　　實時熒光定量結(jié)果顯示，在牙鲆未受精卵沒有檢測到k

7、iss2的表達，且在胚胎發(fā)育期間均保持較低的表達水平。而在孵化后仔魚中kiss2基因的表達量明顯升高，至孵化后第29天（29 dph）達到高峰。gpr54-2基因在牙鲆胚胎及仔魚階段都有表達，在胚胎發(fā)育早期其表達量相對較低，而在孵化后仔魚中表達量升高。至孵化后第36天（36 dph）達到高峰。這些結(jié)果表明kiss2及其受體gpr54-2基因在牙鲆早期發(fā)育階段的表達趨勢基本一致。
　　4 Gpr54-2蛋白在牙鲆成體組織中的表達情況