丹參C2-SRC2-like基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科鼠尾草屬的一種常見(jiàn)藥用植物，入藥部分為其干燥的根和莖，水溶性的酚酸類(lèi)次生代謝物是其重要的藥用成分。植物中的鈣離子作為胞內(nèi)第二信使參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝和脅迫應(yīng)答等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。本研究使用的材料為懸浮培養(yǎng)的丹參細(xì)胞，從丹參中克隆獲得一條含有C2-SRC2特異結(jié)合位點(diǎn)的、編碼能夠結(jié)合鈣離子的C2-SRC2-like蛋白的基因，將其命名為丹參C2-SRC2-like蛋白（C2

2、-SRC2-like基因），并利用生物信息學(xué)在線(xiàn)軟件分析其核酸和氨基酸序列。分別將丹參培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行水楊酸、氯化鈣和缺鈣處理，利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(qRT-PCR)分析丹參C2-SRC2-like基因表達(dá)情況。進(jìn)一步構(gòu)建C2-SRC2-like的過(guò)表達(dá)和反義表達(dá)載體，并用葉盤(pán)法侵染丹參葉片得到過(guò)表達(dá)和反義表達(dá)植株，探究C2-SRC2-like蛋白在丹參酚酸類(lèi)次生代謝物生物合成過(guò)程中的作用。取得了以下主要研究結(jié)果:
　　1、克隆出丹

3、參C2-SRC2-like基因，得到了cDNA全長(zhǎng)。丹參C2-SRC2-like基因包括一個(gè)109bp的5'-非翻譯區(qū)、1134bp的開(kāi)放閱讀框和273bp的3'-非翻譯區(qū)，全長(zhǎng)共1516bp，能夠編碼377個(gè)氨基酸。
　　2、生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)C2-SRC2-like蛋白分子量為38.9kDa，等電點(diǎn)為6.9，是不具信號(hào)肽、含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白。該蛋白可能位于細(xì)胞核，具有C2-SRC2特異結(jié)合位點(diǎn)，屬于C2超家族。與芝麻

4、SRC2-like蛋白的氨基酸序列相似性最高，為72％。
　　3、丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行激素(SA)、信號(hào)分子(Ca2+)和缺鈣處理發(fā)現(xiàn)，水楊酸、過(guò)量鈣能使C2-SRC2-like基因在mRNA水平相對(duì)表達(dá)量顯著提高，且分別在50min和40min達(dá)到峰值，為對(duì)照組的1.9倍和2.3倍;缺鈣處理后C2-SRC2-like基因在mRNA水平顯著并持續(xù)降低。
　　4、成功構(gòu)建了C2-SRC2-like基因的過(guò)表達(dá)和反義表達(dá)載體，為