小麥CONSTANS-like基因的克隆與分析.pdf

1、光周期現(xiàn)象是植物通過(guò)對(duì)晝夜相對(duì)長(zhǎng)度變化的感應(yīng)來(lái)控制開花的一種植物生理現(xiàn)象。光周期對(duì)植物生育期、適應(yīng)性以及產(chǎn)量均具有重要影響。CO(CONSTANS)是植物光周期開花調(diào)控途徑中的一個(gè)重要基因，近年來(lái)在模式植物擬南芥、水稻等植物中CO家族的研究己取得很大的進(jìn)展，但作為主要糧食作物的小麥，其CO基因家族的研究則相對(duì)滯后。因此，克隆和分離小麥CO家族基因并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究有著重要的理論和實(shí)踐意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用同源克隆和cDN

2、A文庫(kù)篩選相結(jié)合的方法克隆到三個(gè)小麥CONSTANS-like基因家族基因：TaCOLX、TaCOL4和TaCOL5；通過(guò)序列分析研究了它們的結(jié)構(gòu)、序列同源性和序列多態(tài)性；通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，對(duì)TaCOLX、TaCOL4基因的功能進(jìn)行研究。主要研究進(jìn)展如下：
　　 1.利用同源克隆和cDNA文庫(kù)篩選相結(jié)合的方法，克隆得到三個(gè)小麥CONSTANS-like基因家族基因：TaCOLX、TaCOL4和TaCOL5。TaCOLX基

3、因序列含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，CDS序列中960bp的開放閱讀框編碼320個(gè)氨基酸，具有兩個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域；TaCOL4基因序列含有一個(gè)外顯子，CDS序列中1266bp的開放閱讀框編碼422個(gè)氨基酸，具有一個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域；TaCOL5基因的CDS序列中978bp的開放閱讀框編碼326個(gè)氨基酸，具有一個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域；B-box和CCT結(jié)構(gòu)域是有CONSTANS-like家

4、族基因典型的結(jié)構(gòu)域，表明它們都編碼一個(gè)CONSTANS-like蛋白。
　　 2.設(shè)計(jì)TaCOLX和TaCOL4的A、B和D基因組的非特異引物，對(duì)普通小麥中國(guó)春進(jìn)行擴(kuò)增。分離得到TaCOLX的三個(gè)同源基因，分別命名為：TaCOLX-A、TaCOLX-B、TaCOLX-D，它們的核苷酸序列相似度大于97.1％；同樣分離得到TaCOL4的三個(gè)同源基因，分別命名為：TaCOL4-A、TaCOL4-B、TaCOL4-D，它們的氨基酸序列

5、相似度大于97.6％。
　　 3.利用11份小麥親本材料對(duì)TaCOLX和TaCOL4-D進(jìn)行序列多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)在這些材料中只有TaCOLX-A在5’UTR區(qū)有一處9bp的缺失；TaCOL4-D在編碼區(qū)有2個(gè)SNP位點(diǎn)，在5’UTR端有15個(gè)SNP位點(diǎn)。
　　 4.利用中國(guó)春缺四體材料對(duì)TaCOLX-D和TaCOL4-D進(jìn)行染色體定位，將TaCOLX-D定位在小麥2D染色體上，將TaCOL4-D定位于小麥7D染色體上；根

6、據(jù)TaCOL4-D在M6和Opata85間的一個(gè)等位基因單堿基差異設(shè)計(jì)標(biāo)記，并利用M6×Opata85作圖群體，將TaCOL4-D定位在小麥7D染色體標(biāo)記Xfba8和Xgwm111之間，遺傳距離分別為4.0cM和1.7cM。
　　 5.分別構(gòu)建了TaCOLX和TaCOL4基因的載體并轉(zhuǎn)化水稻，分別得到兩基因的T0代轉(zhuǎn)基因水稻，且表現(xiàn)型都為延遲水稻抽穗期。對(duì)它們的T1代轉(zhuǎn)基因水稻鑒定發(fā)現(xiàn)抽穗期晚的表現(xiàn)型與基因型共分離，故TaCOL