水稻CONSTANS-like基因OsCOL10作用于光周期開花途徑的分子遺傳與生化分析.pdf

1、水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的糧食作物之一。水稻開花時間（也叫抽穗期）是與其產(chǎn)量息息相關(guān)的農(nóng)藝性狀。適宜的開花時間不僅是水稻成功繁殖的必備條件，決定著水稻的播種時間以及播種范圍，還是其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的一個重要指標(biāo)。適當(dāng)?shù)某樗肫谘舆t，可以積累更多的營養(yǎng)物質(zhì)，提高作物的產(chǎn)量。光周期是目前研究最多且影響水稻抽穗期最重要的環(huán)境因子之一。因此，光周期控制開花途徑中相關(guān)基因的克隆及分子機理的研究，對構(gòu)建水稻開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上

2、適當(dāng)改變抽穗期、提高作物產(chǎn)量具有重大理論和實踐意義。CONSTANS(CO)是模式植物擬南芥光周期開花途徑中最關(guān)鍵的基因。在水稻中，CONSTANS-like(COL)基因家族包含至少16個成員，目前該家族大部分成員的功能未知。本研究中，我們首先通過篩選水稻轉(zhuǎn)錄因子顯性功能獲得型突變體庫（pubi::TFs-VP64），鑒定了一個參與水稻開花調(diào)控的COL基因并命名為OsCOL10；然后，構(gòu)建OsCOL10過表達、干擾等轉(zhuǎn)基因水稻株系并分

3、析它們的表型以及比較各開花基因在轉(zhuǎn)基因植株與野生型中的表達來確認OsCOL10在調(diào)控水稻開花中的角色；接著，我們對OsCOL10的基本特性進行了鑒定，包括它的進化分析，表達模式，亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性分析等；通過比較OsCOL10在各開花突變體或近等基因系和相應(yīng)野生型中的表達來明確OsCOL10調(diào)控光周期開花的機理以及它在水稻開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的位置。最后，我們選取了具有地理分布代表性的100個水稻品種，對OsCOL10進行了單倍型分析。

4、具體結(jié)果如下：
　　（1）從轉(zhuǎn)基因庫中獲得的兩個獨立的純合轉(zhuǎn)基因株系（OsCOL10-VP64-OX4和OsCOL10-VP64-OX7）在長短日照下相對野生型均表現(xiàn)晚開花，并伴有植株增高，穗子變大，產(chǎn)量提高等表型。為了研究延遲開花是否由生長過慢引起，我們同時調(diào)查了植株的出葉速率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株與野生型有著相似的出葉速率，說明轉(zhuǎn)基因植株中延遲的開花表型不是由生長過慢而是成花誘導(dǎo)抑制引起。過表達OsCOL10（pubi::OsC

5、OL10）在長短日照下出現(xiàn)類似的晚花表型，表明OsCOL10是水稻中組成型的開花抑制子。
　?。?）通過比較水稻光周期開花相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株之間的表達差異，發(fā)現(xiàn)OsCOL10負調(diào)控開花主要是通過抑制Ehd1從而抑制下游成花素基因Hd3a及RF T1的表達而實現(xiàn)的。
　?。?）利用生物信息學(xué)手段，對擬南芥和水稻CO-like家族成員進行進化樹分析，發(fā)現(xiàn)CO-like蛋白進化上可以劃分為三個亞家族，其中OsCOL10屬

6、于第二組，該組中還未有成員被報導(dǎo)參與開花調(diào)控。OsCOL10包含一個位于N端的B-box鋅指結(jié)構(gòu)域和一個位于C端的CCT結(jié)構(gòu)域。利用其氨基酸序列BLAST，發(fā)現(xiàn)它在其它禾本科植物中均有同源蛋白，然而這些蛋白功能均未知。
　?。?）OsCOL10的表達在長短日照下都表現(xiàn)出以24小時為周期的晝夜節(jié)律，短日照下在清晨達到最高，長日照下在正午達到最高。另外，隨著植株的發(fā)育，OsCOL10的表達先逐步增加，達到高峰后逐漸降低。我們把在12小

7、時光照，12小時黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28天的水稻，于黃昏時移至連續(xù)光照（LL）和連續(xù)黑暗（DD）條件處理4天。當(dāng)移動至LL或者DD條件下，盡管OsCOL10的表達有所下降，但是仍然具有節(jié)律性，說明OsCOL10受節(jié)律鐘調(diào)控。
　?。?）實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測OsCOL10在水稻各個組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了根部檢測不到其表達外，其它組織都能檢測到OsCOL10的

8、表達，并且其在葉片中的表達量最高。pOsCOL10::GUS植株染色得到相似的結(jié)果，切片觀察還發(fā)現(xiàn)GUS信號主要分布在維管束的外圍。用OsCOL10特異性的探針對葉片的石蠟切片進行原位雜交實驗，進一步證明雜交信號主要集中于維管束外圍的葉肉細胞中。
　　（6）OsCOL10是一個轉(zhuǎn)錄因子?；驑尳閷?dǎo)的瞬時表達顯示OsCOL10定位于洋蔥表皮細胞的細胞核中。在Ubiquitin(UBI)啟動子啟動的OsCOL10-GFP轉(zhuǎn)基因水稻根中

9、，我們可以清楚的看到OsCOL10定位于細胞核中。轉(zhuǎn)錄自激活分析表明，OsCOL10具有微弱的轉(zhuǎn)錄自激活活性，并且B-box鋅指與CCT結(jié)構(gòu)域之間的中間區(qū)域?qū)τ贠sCOL10轉(zhuǎn)錄激活活性是必需的。這些結(jié)果表明OsCOL10在調(diào)控細胞核基因表達中起重要作用。
　?。?）通過比較OsCOL10在不同的開花突變體或者近等基因系與相應(yīng)的野生型間的表達差異，發(fā)現(xiàn)長日照下OsCOL10在NIL(Ghd7)中的表達要高于NIL(ghd7)。我們