矮牽牛PhTCP2基因的克隆、表達(dá)分析及超量表達(dá)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子是能與真核基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白。TCP基因家族的轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，這個(gè)家族的基因有共同的結(jié)構(gòu)域-TCP結(jié)構(gòu)域。根據(jù)TCP結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，TCP基因家族又分為兩個(gè)亞家族classⅠ和classⅡ。根據(jù)TCP結(jié)構(gòu)域的差異，classⅡ又被細(xì)分為兩個(gè)分支ECE和CIN，其中ECE支又包含有三個(gè)亞類(lèi)CYC1、CYC2和CYC3。現(xiàn)有的研究顯示，TCP基因家族基因的功能主要有:參與植

2、物兩側(cè)對(duì)稱花型的發(fā)育、控制植株的分枝及調(diào)控葉片的發(fā)育等。
　　 目前，對(duì)CYC2支的研究多是集中在花器官上，對(duì)全株其它組織的研究較少。mRNA原位雜交和啟動(dòng)子分析表明，擬南芥的AtTCP1在葉柄、花序軸和莖、葉的特定區(qū)域、發(fā)育初期的花分生組織和腋芽分生組織中表達(dá)，具有調(diào)控植物組織發(fā)育的功能。矮牽牛的PhTCP2基因?qū)儆贓CE-CYC2支，我們推測(cè)其可能與花或者莖葉的發(fā)育相關(guān)。
　　 本文通過(guò)從矮牽牛Mitchell Di

3、ploid(MD)中克隆得到PhTCP2基因，對(duì)其在矮牽牛各個(gè)組織中的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析，通過(guò)對(duì)PhTCP2基因在矮牽牛中的超量表達(dá)和PhTCP2基因沉默研究來(lái)分析該基因的功能。
　　 1.矮牽牛PhTCP2基因的克隆
　　 根據(jù)已登陸的矮牽牛TCP轉(zhuǎn)錄因子基因PhTCP2(GenBank accession number:JQ400105) cDNA編碼框序列。設(shè)計(jì)并合成特異引物PT02F/PT02R，以矮牽牛MD的

4、DNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得PhTCP2基因DNA序列，并對(duì)其分析。
　　 2.矮牽牛PhTCP2基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析
　　 通過(guò)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)矮牽牛PhTCP2基因在矮牽牛MD各個(gè)時(shí)期、組織中的表達(dá)情況，PhTCP2基因有較高的組織表達(dá)特異性，在20葉期的莖中表達(dá)量最高，其它時(shí)期的莖中表達(dá)量較低;在腋芽中也有表達(dá)，葉和開(kāi)放的花中基本看不到表達(dá)，但花蕾中有少量表達(dá)。推測(cè)矮牽牛PhTCP2基因可能參與莖生長(zhǎng)

5、發(fā)育的調(diào)控。
　　 3.矮牽牛PhTCP2基因超量表達(dá)研究
　　 將目的基因PhTCP2編碼區(qū)序列連接到克隆載體pMF500中，然后將表達(dá)盒連接到表達(dá)載體pCAMBIA2301中，構(gòu)建植物超表達(dá)載體。將超表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)入矮牽牛MD中，通過(guò)一系列的抗性篩選、GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)及DNA水平的PCR檢測(cè)，篩選出轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平檢測(cè)，選取表達(dá)量高的植株進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)PhT

6、CP2超量表達(dá)的矮牽牛較野生矮牽牛株高變矮。
　　 4.矮牽牛PhTCP2基因沉默研究
　　 利用pGREEN雙元載體系統(tǒng)構(gòu)建PhTCP2基因的SRDX沉默載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化矮牽牛MD、抗性篩選得到抗性植株。對(duì)抗性植株進(jìn)行噴施草胺磷、DNA水平PCR檢測(cè)后篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。觀察轉(zhuǎn)基因植株表型，發(fā)現(xiàn)PhTCP2基因沉默的矮牽牛葉片變圓，株高也較野生型矮牽牛高。
　　 對(duì)矮牽牛Ph TCP2基因功能的