矮牽牛組織培養(yǎng)體系的建立和ACO基因cDNA的克隆.pdf

1、矮牽牛(Petunia hybrida Vilm)花大色艷,花色豐富,廣泛應(yīng)用于花壇布置,景點(diǎn)擺設(shè),窗臺點(diǎn)綴,家庭裝飾中,深受各國人民喜愛。在我國,隨著人們生活水平的提高,對矮牽牛需求量日益增加。矮牽牛是一個雜交種,通過播種繁殖,發(fā)芽率很低,且不易保持親本優(yōu)良性狀。矮牽牛和其他鮮切花一樣,隨著花朵的開放而迅速衰老,如何延緩花卉的衰老,延長花卉的觀賞期已成為近年來專家們研究的主要課題之一。本研究通過克隆矮牽牛ACC氧化酶基因cDNA片段,

2、擬構(gòu)建其RNAi表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入到矮牽牛愈傷組織中,通過組織培養(yǎng)再生體系,獲得完整的再生植株。
　　 本研究以矮牽牛子葉為材料,篩選出了矮牽牛組織培養(yǎng)各階段的適宜培養(yǎng)基,成功地獲得了矮牽牛組織培養(yǎng)再生植株,建立了矮牽牛組織培養(yǎng)植株再生體系；以矮牽牛衰老花瓣為材料,提取了花瓣組織總RNA,通過特異引物RT-PCR,克隆到矮牽牛ACC氧化酶基因cDNA片段,為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ),本研究取得的主要成果如下:
　　 1.建立了矮

3、牽牛組織培養(yǎng)再生體系(1)矮牽牛種子消毒本研究采用了二次化學(xué)試劑消毒法,75％乙醇和0.1％升汞組合使用,這兩種試劑最適消毒消毒時間分別為30s與8min；
　　 (2)矮牽牛子葉誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生和增殖的最適培養(yǎng)基都為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA;
　　 (3)矮牽牛子葉愈傷組織誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的最適培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA;
　　 (4)不定芽增殖和生根

4、的最適培養(yǎng)基都為1/2MS；
　　 (5)矮牽牛苗移栽最適基質(zhì)為泥炭土:珍珠巖=1:1,移栽存活率可達(dá)66.7％；
　　 (6)矮牽牛愈傷組織Hyg抗性篩選最適濃度為10mg/L。
　　 2.建立了適合矮牽牛衰老花瓣總RNA提取的改良Trizol試劑法在傳統(tǒng)Trizol試劑法基礎(chǔ)上,對其進(jìn)行改良。結(jié)果表明,改良的Trizol試劑法能有效去除矮牽牛衰老花瓣中色素等物質(zhì),28S和18SrRNA條帶清晰可見,亮度比在1

5、.0-2.0之間,OD260/OD280平均值為1.75,OD260/OD230平均值為1.91。
　　 3.矮牽牛ACC氧化酶基因cDNA片段的獲得以矮牽牛衰老花瓣為材料,提取矮牽牛衰老花瓣總RNA；經(jīng)RT反轉(zhuǎn)錄合成了第一鏈cDNA；根據(jù)ACC氧化酶的保守序列,設(shè)計合成了一對特異引物；經(jīng)PCR擴(kuò)增和克隆,得到矮牽牛ACC氧化酶基因cDNA特異片段；在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比較,該片段具有高度保守性,與矮牽牛ACC氧化酶基