矮牽牛和小花矮牽牛原生質(zhì)體分離培養(yǎng)及再生.pdf

1、矮牽牛（Petunia hybrida）素有“花壇植物之王”的美譽(yù)。目前矮牽?；ㄉ贩N豐富，但由于花色素代謝特征和基因資源限制，黃色花及橙色花品種極為少見；小花矮牽牛（Calibrachoa hybrida）與矮牽牛為同科不同屬的植物，近幾年廣為栽培，具有各種鮮亮的黃色、橙色品種，可以為黃色矮牽牛品種培育提供基因資源，但兩者親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，存在明顯的有性雜交障礙，難以獲得遠(yuǎn)緣雜交后代。植物體細(xì)胞融合技術(shù)可克服遠(yuǎn)緣雜交親和性差的困難，為

2、培育黃色矮牽牛種質(zhì)資源提供一條可行途徑。本實(shí)驗(yàn)以矮牽牛錦浪系列(Petunia hybrida?Shock Wave‘)白色花品種和小花矮牽牛（Calibrachoa hybrid?lindurayellow‘）黃色花品種為材料，探索影響葉肉原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)的諸多因素，建立適合該品種矮牽牛和小花矮牽牛的原生質(zhì)體分離以及培養(yǎng)體系，為矮牽牛和小花矮牽牛通過體細(xì)胞融合培育矮牽牛新品種奠定基礎(chǔ)。
　　1.矮牽牛原生質(zhì)體分離培養(yǎng)及再生

3、r>　　（1）原生質(zhì)體分離體系的建立
　　以頂芽下第3-5節(jié)上完全伸展的幼嫩葉片為材料，通過對(duì)甘露醇濃度、水解酶種類及濃度、酶解時(shí)間、離心加速度等因素的比較得到適宜分離條件為，酶解液由2%纖維素酶+0.2%果膠酶+0.4%離析酶+0.5 M甘露醇+20 mM MES+0.1%BSA+0.11%CaCl2組成，靜置酶解5 h，1100 rpm離心2 min，升降加速度為0。原生質(zhì)體產(chǎn)量及活性可分別達(dá)到2.90×106個(gè)·g-1和88

4、.1%。
　　（2）原生質(zhì)體培養(yǎng)及再生
　　通過對(duì)培養(yǎng)方法、激素濃度及原生質(zhì)體培養(yǎng)密度等因素的比較得到，適宜的培養(yǎng)條件為，純化后的原生質(zhì)體在KM8P+0.5 mg/l6-BA+2.0 mg/l NAA培養(yǎng)基中固液培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為0.5×105個(gè)/ml，黑暗環(huán)境24℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)17 d后形成肉眼可見的乳黃色微愈傷組織，培養(yǎng)30 d后，將微愈傷組織轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為MS+2%蔗糖+0.7%瓊脂+0.5 mg/l6

5、-BA+0.5 mg/l NAA，培養(yǎng)溫度(24±1)℃，光照14h·d-1，光照強(qiáng)度3000 lux，20 d后微愈傷組織長至5 mm，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中:
　　（1）培養(yǎng)基成分為MS+2%蔗糖+0.7%瓊脂+0.5 mg/l6-BA+0.1 mg/l NAA，第13 d分化出根；
　　（2）培養(yǎng)基成分為MS+2%蔗糖+0.7%瓊脂+1.0 mg/l ZT+0.1 mg/l NAA，第16 d分化出芽。
　　2．小花

6、矮牽牛原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)
　　（1）原生質(zhì)體分離體系的建立
　　以幼嫩葉片為材料，通過對(duì)甘露醇濃度、水解酶種類及濃度、酶解時(shí)間、預(yù)處理方式等因素的比較得到，適宜分離條件為，4℃黑暗預(yù)處理葉片24 h，酶液成分為2%纖維素酶+0.2%果膠酶+0.8%離析酶+0.25 M甘露醇+20 mM MES+0.1%BSA+0.11%CaCl2，靜置酶解5 h，1200 rpm離心2 min，升降加速度為0。原生質(zhì)體產(chǎn)量及活性可分別達(dá)到5

7、.60×106個(gè)·g-1和87%。
　?。?）原生質(zhì)體培養(yǎng)體系的建立
　　通過對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)方法、激素濃度及培養(yǎng)密度等因素的比較得到，適宜的培養(yǎng)條件為，純化后的原生質(zhì)體在KM8P+0.5 mg/l6-BA+0.5 mg/l NAA培養(yǎng)基中固體培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為0.5~1.0×105個(gè)/ml，黑暗環(huán)境24℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)第3 d原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁，第4-5 d開始第一次分裂，分裂頻率為0.6%，21 d后可肉眼觀察到培養(yǎng)皿中白色