MIGS技術在矮牽牛上的應用.pdf

1、基因沉默技術作為研究基因功能的重要工具之一，在植物分子生物學研究和遺傳改良等方面得到廣泛應用。自基因沉默現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)以來，多種基因沉默技術相繼建立，包括共抑制、反義RNA、hpRNAi和VIGS等，然而，這些方法都有其局限性。MIGS沉默技術作為一種新的植物基因沉默技術，在基因沉默的高效性方面有了很大改進。MIGS沉默技術利用擬南芥miR173介導產生一系列tasiRNA，tasiRNA數量巨大，與靶基因互補發(fā)揮沉默效應，MIGS沉默技術調

2、控的效率具有優(yōu)勢。
　　目前，MIGS沉默技術在矮牽牛上的應用尚未見報道。通過該沉默技術對矮牽牛的八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)和查爾酮合成酶基因(CHS)進行沉默實驗，并分析該沉默技術在矮牽牛上沉默效應。以綠色愈傷組織失綠，花顏色發(fā)生變化作為標記，表型變化易于觀察，可以對基因沉默載體的效果進行快速評價，有利于節(jié)省時間，提高工作效率，并且可以為利用MIGS沉默技術研究矮牽牛相關基因的功能奠定基礎。此外，該技術還可以用于對矮牽牛的

3、性狀進行改造，為矮牽牛品種改良提供理論和實踐指導，因此本實驗具有重要的研究意義。獲得的結果如下:
　　1、MIGS沉默技術在矮牽牛上的研究
　　以pGREEN雙元載體系統(tǒng)為基礎，構建在矮牽牛上應用的MIGS沉默載體。MIGS沉默載體包括:miR173基因，帶有miR173靶位點的目的基因片段、報告基因。在設計PCR擴增目的基因序列的引物時，將上游引物5'端額外加上與miR173互補的序列，擴增出的目的基因片段就帶有了miR1

4、73的靶位點，從而在轉基因植株內使miR173與連接在目的基因序列5'端的靶序列互補結合行使功能。
　　2、TA克隆在MIGS沉默載體構建上的應用
　　在擬表達目的片段啟動子和終止子序列之間引入兩個XcmI酶切位點，得到MIGS沉默基礎表達載體pMIGS-T。以pMIGS-T為基礎構建基因沉默植物表達載體時，可直接將目的基因PCR的擴增產物與XcmI單酶切后的pMIGS-T載體相連，選擇正向的連接產物，即完成植物表達載體的構

5、建。大大縮短構建過程，節(jié)省人力物力。
　　3、矮牽牛PhPDS基因的克隆
　　根據對矮牽牛PDS基因EST序列進行分析，并設計引物。通過RACE技術克隆得到矮牽牛PDS基因的cDNA全長序列，將其命名為PhPDS(GenBank accessionnumber: KP677483)。該基因全長1749bp，編碼583個氨基酸。矮牽牛中PDS基因的克隆可以為驗證MIGS沉默技術在矮牽牛中的應用，提供一個直觀快捷的內源檢測報告基

6、因，并為研究矮牽牛PhPDS基因的進化提供了依據。通過半定量RT-PCR反應檢測矮牽牛PhPDS基因在矮牽牛MD不同組織中的表達情況，PhPDS基因有較高的組織表達特異性，在6葉期的莖和葉中表達量最高，根中表達量較低，在成熟期的花中也有少量表達，預測矮牽牛PhPDS基因可能參與植物生長發(fā)育的調控。
　　4、植物表達載體的構建
　　選取矮牽牛八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)和查爾酮合成酶基因(CHS)做為靶基因，利用miR17

7、3誘導的基因沉默(MIGS)技術體系改變矮牽牛的顏色和花色性狀，使轉基因植株的表型變化更加容易觀察。將目的基因序列連接到表達載體pMIGS-T中，構建植物MIGS沉默載體。分別將重組質粒利用農桿菌介導轉入矮牽牛MD品系和地毯品系中，通過一系列的抗性篩選及DNA水平檢測，篩選出轉基因矮牽牛植株。對轉基因矮牽牛進行表型觀察發(fā)現(xiàn)沉默PhPDS基因的矮牽牛接種大約2周后，開始出現(xiàn)白色的愈傷，沉默CHS基因的矮牽牛轉基因植株花瓣褪色，由紫色花變成

8、了白色花，由此證明MIGS沉默技術體系能夠在矮牽牛中應用。
　　5、MIGS技術對矮牽牛的沉默效應
　　提取表型變化明顯的轉基因植株RNA，對轉錄后表達水平檢測，結果表明轉基因植株中CHS，PDS基因的表達量顯著減少;通過RACE技術對CHS，PDS基因的剪切進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)CHS，PDS基因被剪切的位點較多，這與miR173可以介導產生一系列發(fā)揮沉默效應的tasiRNA結果一致，對small RNA進行測定，分析沉默的效