版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、基因沉默技術(shù)作為研究基因功能的重要工具之一,在植物分子生物學(xué)研究和遺傳改良等方面得到廣泛應(yīng)用。自基因沉默現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)以來,多種基因沉默技術(shù)相繼建立,包括共抑制、反義RNA、hpRNAi和VIGS等,然而,這些方法都有其局限性。MIGS沉默技術(shù)作為一種新的植物基因沉默技術(shù),在基因沉默的高效性方面有了很大改進(jìn)。MIGS沉默技術(shù)利用擬南芥miR173介導(dǎo)產(chǎn)生一系列tasiRNA,tasiRNA數(shù)量巨大,與靶基因互補發(fā)揮沉默效應(yīng),MIGS沉默技術(shù)調(diào)
2、控的效率具有優(yōu)勢。
目前,MIGS沉默技術(shù)在矮牽牛上的應(yīng)用尚未見報道。通過該沉默技術(shù)對矮牽牛的八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)和查爾酮合成酶基因(CHS)進(jìn)行沉默實驗,并分析該沉默技術(shù)在矮牽牛上沉默效應(yīng)。以綠色愈傷組織失綠,花顏色發(fā)生變化作為標(biāo)記,表型變化易于觀察,可以對基因沉默載體的效果進(jìn)行快速評價,有利于節(jié)省時間,提高工作效率,并且可以為利用MIGS沉默技術(shù)研究矮牽牛相關(guān)基因的功能奠定基礎(chǔ)。此外,該技術(shù)還可以用于對矮牽牛的
3、性狀進(jìn)行改造,為矮牽牛品種改良提供理論和實踐指導(dǎo),因此本實驗具有重要的研究意義。獲得的結(jié)果如下:
1、MIGS沉默技術(shù)在矮牽牛上的研究
以pGREEN雙元載體系統(tǒng)為基礎(chǔ),構(gòu)建在矮牽牛上應(yīng)用的MIGS沉默載體。MIGS沉默載體包括:miR173基因,帶有miR173靶位點的目的基因片段、報告基因。在設(shè)計PCR擴(kuò)增目的基因序列的引物時,將上游引物5'端額外加上與miR173互補的序列,擴(kuò)增出的目的基因片段就帶有了miR1
4、73的靶位點,從而在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)使miR173與連接在目的基因序列5'端的靶序列互補結(jié)合行使功能。
2、TA克隆在MIGS沉默載體構(gòu)建上的應(yīng)用
在擬表達(dá)目的片段啟動子和終止子序列之間引入兩個XcmI酶切位點,得到MIGS沉默基礎(chǔ)表達(dá)載體pMIGS-T。以pMIGS-T為基礎(chǔ)構(gòu)建基因沉默植物表達(dá)載體時,可直接將目的基因PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與XcmI單酶切后的pMIGS-T載體相連,選擇正向的連接產(chǎn)物,即完成植物表達(dá)載體的構(gòu)
5、建。大大縮短構(gòu)建過程,節(jié)省人力物力。
3、矮牽牛PhPDS基因的克隆
根據(jù)對矮牽牛PDS基因EST序列進(jìn)行分析,并設(shè)計引物。通過RACE技術(shù)克隆得到矮牽牛PDS基因的cDNA全長序列,將其命名為PhPDS(GenBank accessionnumber: KP677483)。該基因全長1749bp,編碼583個氨基酸。矮牽牛中PDS基因的克隆可以為驗證MIGS沉默技術(shù)在矮牽牛中的應(yīng)用,提供一個直觀快捷的內(nèi)源檢測報告基
6、因,并為研究矮牽牛PhPDS基因的進(jìn)化提供了依據(jù)。通過半定量RT-PCR反應(yīng)檢測矮牽牛PhPDS基因在矮牽牛MD不同組織中的表達(dá)情況,PhPDS基因有較高的組織表達(dá)特異性,在6葉期的莖和葉中表達(dá)量最高,根中表達(dá)量較低,在成熟期的花中也有少量表達(dá),預(yù)測矮牽牛PhPDS基因可能參與植物生長發(fā)育的調(diào)控。
4、植物表達(dá)載體的構(gòu)建
選取矮牽牛八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)和查爾酮合成酶基因(CHS)做為靶基因,利用miR17
7、3誘導(dǎo)的基因沉默(MIGS)技術(shù)體系改變矮牽牛的顏色和花色性狀,使轉(zhuǎn)基因植株的表型變化更加容易觀察。將目的基因序列連接到表達(dá)載體pMIGS-T中,構(gòu)建植物MIGS沉默載體。分別將重組質(zhì)粒利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入矮牽牛MD品系和地毯品系中,通過一系列的抗性篩選及DNA水平檢測,篩選出轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株。對轉(zhuǎn)基因矮牽牛進(jìn)行表型觀察發(fā)現(xiàn)沉默PhPDS基因的矮牽牛接種大約2周后,開始出現(xiàn)白色的愈傷,沉默CHS基因的矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株花瓣褪色,由紫色花變成
8、了白色花,由此證明MIGS沉默技術(shù)體系能夠在矮牽牛中應(yīng)用。
5、MIGS技術(shù)對矮牽牛的沉默效應(yīng)
提取表型變化明顯的轉(zhuǎn)基因植株RNA,對轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平檢測,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中CHS,PDS基因的表達(dá)量顯著減少;通過RACE技術(shù)對CHS,PDS基因的剪切進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHS,PDS基因被剪切的位點較多,這與miR173可以介導(dǎo)產(chǎn)生一系列發(fā)揮沉默效應(yīng)的tasiRNA結(jié)果一致,對small RNA進(jìn)行測定,分析沉默的效
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 矮牽牛栽培技術(shù)
- 矮牽牛AGL6同源基因pMADS4在矮牽牛異位表達(dá)的表型分析.pdf
- 矮牽牛和小花矮牽牛原生質(zhì)體分離培養(yǎng)及再生.pdf
- 矮牽牛花的種植
- 矮牽牛PhDHS沉默對葉片的影響.pdf
- 6個矮牽牛品種抗旱性評價及PSARK-IPT基因轉(zhuǎn)化矮牽牛研究.pdf
- 不同DFR基因轉(zhuǎn)化矮牽牛研究.pdf
- 應(yīng)用表型性狀、ISSR和SRAP進(jìn)行矮牽牛自交系親緣關(guān)系的研究.pdf
- 矮牽牛雜交育種的初步研究.pdf
- 基因疊加和MIGS技術(shù)在水稻淀粉途徑中的應(yīng)用.pdf
- 矮牽牛幾個花型相關(guān)基因初步功能鑒定.pdf
- 矮牽牛花藥培養(yǎng)再生體系的建立.pdf
- 激素調(diào)控矮牽牛離體再生花瓣的研究.pdf
- 矮牽牛F-,1-代育種的幾個相關(guān)技術(shù)研究.pdf
- 矮牽牛PhCESA3基因功能鑒定.pdf
- 矮牽?;ㄏ阆嚓P(guān)的ERF篩選及其調(diào)節(jié)機理初探.pdf
- 矮牽牛PMADS9基因的組織結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析.pdf
- 矮牽牛等植物代謝甲醛分子機理的初步研究.pdf
- 矮牽牛耐熱性形態(tài)及生理指標(biāo)的研究.pdf
- 矮牽牛優(yōu)勢組合F2代遺傳分析.pdf
評論
0/150
提交評論