靈芝甾醇14α-脫甲基酶基因的克隆及超量表達(dá)對(duì)三萜合成的影響.pdf

1、靈芝Ganoderma lucidum是一種重要的藥用真菌，因其具有多種治療和保健作用，在我國(guó)已有悠久的藥用歷史?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，靈芝中三萜類物質(zhì)是其主要的活性成分之一，具有抑制組胺釋放、抗腫瘤、抗HIV以及抑制膽固醇的生物合成和吸收等作用。因此，提高靈芝三萜的含量成為進(jìn)一步提高靈芝藥用價(jià)值的重要途徑。
　　 靈芝三萜類物質(zhì)是靈芝的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其合成是通過(guò)甲羥戊酸途徑進(jìn)行的。甲羥戊酸途徑是真核細(xì)胞中合成甾醇和類異戊二烯的重要

2、途徑。甾醇14α-脫甲基酶(Sterol14α-demethylase，P45014-DM，CYP51)是該途徑中的關(guān)鍵酶，催化甾醇前體的14α-甲基羥基化反應(yīng)。因此，cyp51表達(dá)量的高低可能會(huì)直接或間接的影響靈芝中三萜類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及含量。
　　 本文首先通過(guò)比對(duì)已報(bào)道的其它物種的CYP51的氨基酸序列，根據(jù)保守區(qū)段設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，得到350 bp的靈芝cyp51基因特異片段；根據(jù)得到的特異片段分別設(shè)計(jì)5'-SEFA和3'-RA

3、CE特異引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增分別得到該基因的5’末端基因組序列、啟動(dòng)子序列和3’末端cDNA序列；對(duì)得到的片段進(jìn)行拼接、排除可能的內(nèi)含子后設(shè)計(jì)引物，分別以靈芝基因組DNA和cDNA為模板擴(kuò)增得到靈芝cyp51基因的基因組DNA及cDNA全長(zhǎng).其中基因組DNA全長(zhǎng)為1981 bp，cDNA全長(zhǎng)為1635 bp，編碼一個(gè)由544個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，推測(cè)其分子量為61.99kDa，等電點(diǎn)為6.36。對(duì)靈芝甾醇14α-脫甲基酶基因的基因組DN

4、A序列和cDNA序列的對(duì)比分析表明，該基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。應(yīng)用MEGA4.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明靈芝CYP51與樟芝CYP51的親緣關(guān)系最近，且CYP51的進(jìn)化與物種的進(jìn)化關(guān)系是比較一致的。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示Gl-CYP51含有典型的CYP51家族結(jié)構(gòu)域。
　　 為了更全面的了解該基因的表達(dá)特性，我們還對(duì)得到的899 bp的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在-81--131bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)可能的核心啟動(dòng)子區(qū)。該啟動(dòng)子序列

5、包含了典型的真核生物啟動(dòng)子元件，存在6個(gè)推定的 TATA-box，8個(gè)CAAT-box。除了這些基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件外，還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與甾醇、激素和環(huán)境壓力等調(diào)節(jié)相關(guān)的順式作用元件。
　　 為了進(jìn)一步研究甾醇14α-脫甲基酶基因的功能，我們將Gl-cyp51基因的cDNA序列克隆到靈芝超量表達(dá)載體 pGl-GPD中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)了Gl-cyp51基因在靈芝內(nèi)的超量表達(dá)。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)化子的Gl-cyp51基因在轉(zhuǎn)錄水平表