靈芝羊毛甾醇合酶基因的克隆及其表達(dá)特性研究.pdf

1、靈芝（Ganoderma lucidum）在我國(guó)有著悠久的使用歷史，可用于調(diào)理和治療多種疾病。靈芝的主要藥效成分之一是三萜類化合物，具有抗腫瘤作用、抑制組織胺釋放作用、抗HIV和HIV蛋白酶及抑制膽固醇的合成和吸收等作用.所以，三萜類化合物的含量已成為評(píng)定靈芝藥用價(jià)值的重要指標(biāo)。
　　 三萜作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，是通過(guò)甲羥戊酸（MVA）途徑，經(jīng)過(guò)法呢酯焦磷酸、鯊烯、鯊烯-2，3-氧化物和羊毛甾醇等中間體，最后經(jīng)過(guò)一系列氧化還原以及環(huán)

2、化反應(yīng)形成的。羊毛甾醇合酶（LS）處于甲羥戊酸（MVA）途徑中的第二個(gè)分支點(diǎn)，是萜類化合物合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它可以催化2，3-氧化鯊烯環(huán)化生成羊毛甾醇.LS的含量以及活性高低會(huì)影響到三萜類化合物的產(chǎn)量。
　　 根據(jù)已經(jīng)公布的其它物種LS蛋白質(zhì)序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，以靈芝基因組DNA作為模板，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增，一個(gè)488bp的靈芝LS基因特異DNA片段被得到。利用獲得的基因特異片段，設(shè)計(jì)三條特異的引物，采用SE

3、FAPCR方法，擴(kuò)增獲得LS基因的5’端基因組DNA序列。以靈芝原基為材料制備cDNA，使用此cDNA作為模板，通過(guò)3'-RACE，得到了LS基因的3’端cDNA序列。根據(jù)PCR擴(kuò)增得到的序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了LS基因的全長(zhǎng)cDNA序列。該序列長(zhǎng)度為2181 bp，編碼726個(gè)氨基酸。根據(jù)獲得的序列信息進(jìn)行拼接獲得了LS的全長(zhǎng)基因組（genomic DNA）序列。該序列全長(zhǎng)為2924 bp，LS基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成

4、。氨基酸序列經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，靈芝LS與擔(dān)子菌新型隱球菌Cryptococcusneoformans顯示出最高相似性（53％），這符合靈芝的經(jīng)典分類。將靈芝LS基因cDNA序列插入到酵母表達(dá)載體pYES2中，轉(zhuǎn)入由于缺失LS活性而依賴麥角甾醇（ergosterol）才能生存的酵母突變株osc△。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子能夠在28℃、不添加麥角甾醇（ergosterol）的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而缺陷型單倍體不能生長(zhǎng)，證實(shí)了所獲得的LS基因是有功能的。

5、根據(jù)靈芝LS基因組序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以靈芝基因組DNA（genomic DNA）為模板，擴(kuò)增得到了LS基因啟動(dòng)子序列，此序列長(zhǎng)度為767bp，用PlantCARE對(duì)LS啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示LS基因啟動(dòng)子中存在TATA-box和CAAT-box，同時(shí)還有多個(gè)響應(yīng)光、激素ABA和環(huán)境壓力等因子的順式作用元件。
　　 通過(guò)real-time PCR的方法，對(duì)靈芝不同發(fā)育階段中LS的轉(zhuǎn)錄本差異進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，在靈芝原基時(shí)期

6、，LS的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量要顯著高于菌絲體中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。這種規(guī)律與Hirotani等人所報(bào)道三萜含量的變化規(guī)律相同。在培養(yǎng)基中添加信號(hào)物質(zhì)茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA），可以顯著地誘導(dǎo)靈芝三萜的合成。因此，用不同濃度MeJA處理菌絲體后對(duì)其中LS基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了檢測(cè)。100-200μM MeJA作用下，LS基因的轉(zhuǎn)錄本顯示出連續(xù)性增加，最佳誘導(dǎo)濃度是200μM。同時(shí)，啟動(dòng)子活性分析實(shí)驗(yàn)表明在靈芝LS基因的啟動(dòng)子中至少存