靈芝異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶基因的克隆及其表達(dá)特性的研究.pdf

1、靈芝(Ganoderma lucidum)是一種傳統(tǒng)藥用真菌，在我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中應(yīng)用歷史悠久。被用于治療多種疾病，如肝炎、高血壓、高血脂、胃癌等?，F(xiàn)代藥理研究證明靈芝具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗衰老等藥理作用。在中藥現(xiàn)代化研究進(jìn)程中，人們?cè)陟`芝中分離出其中一類(lèi)重要的藥理活性物質(zhì)并證實(shí)為三萜類(lèi)化合物。
　　 作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，三萜類(lèi)化合物在真菌中是經(jīng)由甲羥戊酸途徑后，形成兩個(gè)五碳單位異戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸。異戊二烯

2、焦磷酸異構(gòu)酶處于甲羥戊酸途徑中的末端，催化無(wú)活性的異戊烯焦磷酸轉(zhuǎn)化為有活性的親核型異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸，進(jìn)而激活五碳化合物鏈的延伸反應(yīng)，是萜類(lèi)化合物合成過(guò)程中的一個(gè)重要的酶；而且它可能通過(guò)調(diào)節(jié)底物異戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的比例來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)代謝終產(chǎn)物的流向。因此研究異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶的表達(dá)特性，對(duì)于運(yùn)用分子生物學(xué)的方法提高靈芝的藥用價(jià)值方面有著重要的意義。
　　 本文通過(guò)已報(bào)道過(guò)的其他物種的IDI1氨基酸序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并

3、引物，PCR擴(kuò)增得到該基因599 bp的特異片段；然后基于獲得的特異片段序列，設(shè)計(jì)特異性5’-SEFA引物，以靈芝菌絲體DNA為模板擴(kuò)增該基因的5’端和啟動(dòng)子區(qū)；通過(guò)3’-RACE的方法，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，擴(kuò)增得到該基因的3’端和3UTR。對(duì)得到的序列進(jìn)行拼接、比對(duì)分析后，設(shè)計(jì)引物，分別以靈芝的基因組DNA和cDNA為模板擴(kuò)增得到異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶基因(idi1)的基因組序列和cDNA全長(zhǎng)序列。基因組全長(zhǎng)為985 bp，cDNA

4、全長(zhǎng)為759 bp，其編碼一個(gè)252個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。對(duì)靈芝異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶基因的基因組序列和cDNA序列的對(duì)比分析表明，該基因由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，它們的長(zhǎng)度分別為59 bp(intronl)、167 bp(intron2)。將該基因轉(zhuǎn)入具有合成β-胡蘿卜素生物合成途徑的大腸桿菌TOP10 F’，發(fā)現(xiàn)該基因的導(dǎo)入使原菌株中的β-胡蘿卜素生物積累顯著增加，通過(guò)這種方法進(jìn)一步證明了我們得到的基因是有功能的。
　　

5、通過(guò)軟件分析，預(yù)測(cè)靈芝IDI1蛋白質(zhì)分子量為28.70777kD，等電點(diǎn)為5.36。利用Plant care網(wǎng)站對(duì)得到靈芝idi1基因及1202bp啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示：靈芝idi1基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有17個(gè)CAAT box、1個(gè)推定的TATA box等典型的真核生物啟動(dòng)子元件.另外，還含2個(gè)Sp1元件、1個(gè)ATC-motif、1個(gè)Box4(光調(diào)控順時(shí)作用元件)，1個(gè)LTR元件(低溫響應(yīng)元件)、1個(gè)Box-W1(真菌激發(fā)子響應(yīng)元

6、件)、2個(gè)auxin-responsiveelement(茁長(zhǎng)素響應(yīng)元件)、1個(gè)MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)、4個(gè)CGTCA-motif、2個(gè)TGACG-motif(茉莉酸甲酯響應(yīng)元件)、2個(gè)MBS(與干旱誘導(dǎo)有關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn))等。
　　 為了研究idi1基因在不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)采用半定量RT-PCR的方法考查了該基因的不同發(fā)育階段mRNA水平，結(jié)果顯示idi1基因在原基時(shí)期表達(dá)量最高；并用相同的方法對(duì)254μM茉莉