眼斑芫菁法呢基焦磷酸合酶FPPS基因的克隆及功能研究.pdf

1、眼斑芫菁民間俗稱黃黑小斑蝥（MylabriscichoriiLinnaeus），為昆蟲(chóng)綱鞘翅目（Coleoptera）芫菁科（Meloidae）斑芫菁屬（Mylabris）昆蟲(chóng)。它是我國(guó)歷史上的傳統(tǒng)中藥材之一，同時(shí)也是我國(guó)藥典收錄的重要?jiǎng)游锼幹?。斑蝥素（Cantharidin），一種倍半萜類的天然防御物質(zhì)。這種毒素物質(zhì)在昆蟲(chóng)體內(nèi)合成的途徑是一個(gè)尚未解決的科學(xué)問(wèn)題。近年來(lái)由于其在臨床醫(yī)學(xué)上具有顯著的抗腫瘤、抗癌等作用，所以人們對(duì)斑蝥素的

2、需求急劇增加，但是芫菁科昆蟲(chóng)的人工飼養(yǎng)難題尚未解決，而且斑蝥素的化學(xué)合成條件苛刻，因此研究斑蝥素的生物合成途徑可能為解決斑蝥素來(lái)源問(wèn)題提供一些新的思路。
　　斑蝥素生物合成的研究已經(jīng)經(jīng)歷了數(shù)十年，并且也取得了一些突破性的成果，但是到目前為止仍沒(méi)有完全弄清楚斑蝥素生物合成的具體途徑。并且關(guān)于斑蝥素生物合成途徑中的基因分子水平、酶水平研究也很少，所以對(duì)斑蝥素生物合成途徑的相關(guān)基因、酶進(jìn)行研究將為弄清楚斑蝥素的生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

3、r>　　本文對(duì)倍半萜類物質(zhì)代謝途徑中的關(guān)鍵酶——法呢基焦磷酸合酶（FPPS）在眼斑芫菁斑蝥素生物合成途徑中的功能進(jìn)行了研究，主要研究結(jié)果如下：
　　1.McFPPS基因cDNA全長(zhǎng)的克隆及序列分析采用SMARTRACE等技術(shù)，克隆獲得了該基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并將其命名為McFPPS，其Genbank登錄號(hào)為KM514312。該基因cDNA全長(zhǎng)為1507bp。使用在線軟件ORFfinder及ExPASy等對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分

4、析，發(fā)現(xiàn)：其開(kāi)放閱讀框?yàn)?278bp，共編碼425個(gè)氨基酸，其理論蛋白分子量為49.452KDa，理論等電點(diǎn)為8.91；McFPPS蛋白有跨膜結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其定位于線粒體膜上，不具有信號(hào)肽。通過(guò)多序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)：McFPPS蛋白包含所有FPPS蛋白的七個(gè)保守區(qū)域I-VII，其中包括兩個(gè)典型的富含天冬氨酸的保守結(jié)構(gòu)域DDXXD。另外，通過(guò)MEGA4軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)對(duì)該蛋白的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)：所有昆蟲(chóng)單獨(dú)聚為一支，其中眼斑芫菁與

5、其他鞘翅目昆蟲(chóng)又單獨(dú)聚為一支，并與豆芫菁（Epicautagorhami）的關(guān)系最近。
　　2.McFPPS基因及其下游基因STE24（命名為McSTE24）的時(shí)期表達(dá)譜分析采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)對(duì)McFPPS基因在雌、雄成蟲(chóng)六個(gè)時(shí)期（5d，10d，15d，20d，25d，30d）的表達(dá)譜進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明McFPPS基因在雌、雄蟲(chóng)的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)。雄蟲(chóng)中，5-20d基因表達(dá)量逐漸升高，20d出現(xiàn)峰值，而2

6、5d-30d其表達(dá)量又逐漸下降，這與McSTE24在雄蟲(chóng)中的表達(dá)模式一致。雌蟲(chóng)中，該基因的表達(dá)量在前15d均變化不大，但在20d-25d時(shí)該基因的表達(dá)量急劇下降，而在30d時(shí)，其表達(dá)量又上升。以上的結(jié)果與眼斑芫菁中斑蝥素含量基本一致。
　　3.McFPPS基因的組織表達(dá)譜分析通過(guò)采用RT-qPCR對(duì)McFPPS基因在雄蟲(chóng)（20d）腹部五個(gè)組織（精巢、附腺、前腸、中腸、后腸）的表達(dá)譜進(jìn)行分析，該分析結(jié)果顯示McFPPS基因在各組織中

7、均有表達(dá)，其中在腸道的表達(dá)量均較高，尤其后腸中的表達(dá)量最高。
　　4.McFPPS基因的干擾體外合成McFPPS基因的雙鏈RNA（dsRNA），并以注射的方式對(duì)17-18d的雄蟲(chóng)及5齡幼蟲(chóng)McFPPS基因進(jìn)行干擾，進(jìn)一步研究該基因的功能。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不管在雄成蟲(chóng)還是幼蟲(chóng)中該基因的24h干擾效率均比48h（與對(duì)照組比較）高，故對(duì)干擾24h樣品中的下游基因表達(dá)量和下游產(chǎn)物含量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明不管在雄成蟲(chóng)還是幼蟲(chóng)中，當(dāng)干擾McF

8、PPS基因后，下游基因的表達(dá)量和斑蝥素的含量均有明顯的降低。
　　5.McFPPS基因的原核表達(dá)通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-McFPPS，成功獲得了該基因的表達(dá)蛋白，并且進(jìn)行了誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，結(jié)果顯示：該基因原核表達(dá)的蛋白分子量與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，并以包涵體的形式表達(dá)。
　　結(jié)論：本研究首次克隆獲得了眼斑芫菁法呢基焦磷酸合酶基因，并將其命名為McFPPS。該基因在眼斑芫菁六個(gè)不同時(shí)期的時(shí)期表達(dá)變化趨勢(shì)與斑蝥素的含量變化一