披堿草（Elymus dahuricus）氫離子焦磷酸化酶基因EdHP1的克隆及功能鑒定.pdf

1、氫離子焦磷酸化酶(H+-PPase)是一類H+轉(zhuǎn)運(yùn)酶，同時(shí)它也是以焦磷酸(PPi)為底物的水解酶。H+-PPase水解PPi產(chǎn)生的自由能與H+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相藕聯(lián)，形成質(zhì)子驅(qū)動力，與H+-ATPase一起將細(xì)胞質(zhì)中的H+泵入液泡中，可以建立跨液泡膜電化學(xué)梯度，為無機(jī)離子及其他溶質(zhì)進(jìn)出液泡提供驅(qū)動力，既能維持細(xì)胞離子平衡和滲透平衡，又能減輕一些無機(jī)離子(如Na+)對細(xì)胞質(zhì)的毒害；同時(shí)，可以使液泡酸化和細(xì)胞質(zhì)堿化，有利于細(xì)胞質(zhì)中生理生化反應(yīng)的順利

2、進(jìn)行。披堿草是禾本科披堿草屬多年生優(yōu)質(zhì)牧草，具有極強(qiáng)的抗旱、耐鹽堿能力。 本研究采用RACE方法，從披堿草中克隆了氫離子焦磷酸化酶基因EdHP1，分析了該基因的生物信息、表達(dá)模式和功能鑒定，并確定了氫離子焦磷酸化酶蛋白的亞細(xì)胞定位。 (1)克隆了披堿草基因EdHP1的eDNA序列，其序列包括2310 bp的開放讀碼框架和356 bp 3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼770個(gè)氨基酸；其蛋白含有14個(gè)跨膜區(qū)，是一

3、個(gè)典型的膜蛋白，同時(shí)包含三個(gè)保守區(qū)(CS1、CS2和CS3)。氨基酸同源性比較發(fā)現(xiàn)，EdHP1與來自大麥等10種高等植物的焦磷酸化酶的同源性大于86％，與大麥焦磷酸化酶的同源性高達(dá)98％，可見H+-PPase在高等植物中是高度保守的。 (2)亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，EdHP1定位在質(zhì)膜上。 (3)．EdHP1基因的表達(dá)模式分析說明，該基因的表達(dá)受干旱、高鹽、低溫、低磷、低鉀以及重金屬CA2+,等非生物脅迫的誘導(dǎo)。在干旱、

4、高鹽、低磷、低鉀條件下，EdHP1基因的表達(dá)從1h開始逐漸增強(qiáng)，在24噠到最大；在低溫脅迫下，EdHP1表達(dá)先增強(qiáng)后減弱，5h表達(dá)量最高，12h表達(dá)量開始下降：在重金屬Cd2+條件下，EdHP1的表達(dá)從1h開始逐漸增強(qiáng)，在12h達(dá)到最大，24h后有所減弱。 (4)EdHP1基因的功能分析證明，在干旱、高鹽、低溫、低磷、低鉀以及重金屬Cd2+等脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草生長都明顯比野生型煙草好；其地上部分的生長量明顯大于野生型對照；根

5、系也明顯比野生型對照發(fā)達(dá)；對煙草中H+-PPase的活性進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的酶活性明顯比野生型對照高。在高鹽和重金屬Cd2+脅迫條件下，對轉(zhuǎn)基因煙草和野生型對照中的Na+和Cd2+含量進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，野生型對照中Na+和Cd2+的含量明顯比轉(zhuǎn)基因煙草中高，可見EdHP1能將Na2+和Cd2+泵到胞外。而在低磷和低鉀條件下，轉(zhuǎn)基因煙草中磷和鉀的含量明顯比對照高，可見EdHP1能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草對磷和鉀元素的吸收。這就證明EdHP1基因不僅

6、能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草抵御干旱、高鹽和重金屬Cd2+離子的脅迫的能力，而且促進(jìn)植物磷和鉀元素的吸收。 本研究首次從披堿草中克隆了EdHP1基因，通過亞細(xì)胞定位的方法證明了EdHP1是H+-PPase家族中的一個(gè)新型質(zhì)膜蛋白，通過RT-PCR和Northern的方法比較全面的分析了EdHP1基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)模式，比較系統(tǒng)的對其功能進(jìn)行了鑒定，明確了質(zhì)膜型EdHP1的功能。本研究不但豐富了H+-PPase家族，而且為作物抗逆遺傳改