氫離子焦磷酸化酶基因VP1調(diào)控植物抗逆反應(yīng)的分子機(jī)制解析及在小麥中的應(yīng)用研究.pdf

1、氫離子焦磷酸化酶（H+-PPase）是植物重要的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，它以焦磷酸（PPi）為底物將其水解為2個(gè)磷酸，同時(shí)生成能量，并與質(zhì)子（H+）跨膜運(yùn)輸過(guò)程耦聯(lián)，在另一種質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氫離子ATP酶（H+-ATPase）協(xié)同下將胞質(zhì)中的H+轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡中或胞外，在膜內(nèi)外維持一定的質(zhì)子梯度，為離子和其它溶質(zhì)的次級(jí)主動(dòng)運(yùn)輸提供動(dòng)力。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道在植物中過(guò)表達(dá)不同來(lái)源的H+-PPase基因可以促進(jìn)植物根系發(fā)育，顯著提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐低磷脅迫

2、的能力，證明H+-PPase在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用等方面發(fā)揮著重要的作用，但目前關(guān)于H+-PPase的研究主要集中在基因功能及生理機(jī)制研究方面，其相關(guān)的信號(hào)途徑及分子調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，篩選與H+-PPase互作的蛋白并研究其互作蛋白的功能對(duì)于揭示H+-PPase的分子調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。
　　文獻(xiàn)報(bào)道擬南芥的H+-PPase基因AVP1可以顯著提高植物的抗逆性。本研究以擬南芥AVP1為誘餌采用膜蛋白酵母雙

3、雜交系統(tǒng)篩選擬南芥cDNA文庫(kù)，獲得一批與AVP1互作的蛋白。其中，酵母互作試驗(yàn)驗(yàn)證了三個(gè)互作蛋白包括小 GTP結(jié)合蛋白 AtRAB、蛋白激酶AtAZK、受體蛋白激酶 AtRLK與AVP1的互作關(guān)系。雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（BiFC）證明AVP1和上述三個(gè)蛋白能在細(xì)胞膜或/和細(xì)胞核上發(fā)生相互作用。擬南芥基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)顯示AVP1和互作蛋白AtRAB都受到滲透、高鹽和干旱等脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。以AVP1三個(gè)互作蛋白的擬南芥突變體rab、azk

4、、rlk和AVP1的擬南芥突變體avp1為實(shí)驗(yàn)材料，分別進(jìn)行ABA、高鹽、低磷、低鉀脅迫的處理，比較這些突變體與野生型擬南芥（WT）的表型，分析這些 AVP1互作蛋白基因在非生物脅迫條件下的功能。結(jié)果顯示：1、在 ABA處理?xiàng)l件下，突變體rab的表型與avp1類似，相對(duì)于WT都表現(xiàn)為根長(zhǎng)縮短，證明AtRAB與AVP1都參與ABA信號(hào)途徑。在低磷處理?xiàng)l件下，突變體rab與突變體avp1的表型類似，相對(duì)于WT都表現(xiàn)于根系生長(zhǎng)受到抑制，證明A

5、tRAB與AVP1都正向調(diào)控植物的低磷脅迫響應(yīng)。2、在高鹽處理?xiàng)l件下，突變體azk和突變體avp1表型類似，相對(duì)于WT都表現(xiàn)為根系生長(zhǎng)受到抑制，說(shuō)明AtAZK和AVP1在植物耐鹽反應(yīng)中都起正向作用。3、在低鉀處理?xiàng)l件下，突變體rab、突變體rlk對(duì)低鉀處理的反應(yīng)同突變體avp1較為類似，其中，突變體rlk對(duì)低鉀脅迫更為敏感，說(shuō)明AtRLK和AVP1正向調(diào)控植物對(duì)低鉀脅迫的響應(yīng)?？傊?，在ABA和低磷處理?xiàng)l件下，AtRAB和AVP1突變體表

6、型類似；在高鹽處理?xiàng)l件下，AtAZK和AVP1突變體表型類似；在低鉀處理?xiàng)l件下，AtRLK和AVP1表型類似，結(jié)合這些互作蛋白與AVP1互作關(guān)系的驗(yàn)證結(jié)果初步推測(cè)三個(gè)互作蛋白AtRAB、AtAZK、AtRLK與AVP1處于相同信號(hào)途徑中，參與AVP1在不同脅迫條件下的分子調(diào)控，影響植物對(duì)高鹽、低磷和低鉀脅迫的抗性。
　　本研究前期工作為了篩選新的H+-PPase基因用于小麥抗逆遺傳改良，從小麥近緣植物披堿草中克隆新的H+-PPas

7、e基因EdVP1，在煙草中過(guò)表達(dá)EdVP1基因可以顯著改良其耐高鹽及低鉀脅迫的能力，進(jìn)而采用基因槍法將 EdVP1基因轉(zhuǎn)化小麥品種鄭147。本研究利用轉(zhuǎn) EdVP1基因小麥為實(shí)驗(yàn)材料，在鄭州國(guó)家土壤肥力長(zhǎng)期定位實(shí)驗(yàn)地進(jìn)行田間養(yǎng)分吸收實(shí)驗(yàn)，鑒定轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)低磷、低鉀、低氮等不同養(yǎng)分脅迫的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)EdVP1基因的小麥植株能在一定程度上提高小麥的產(chǎn)量，同時(shí)能夠促進(jìn)小麥株系對(duì)肥料的利用率。在不施肥及施NPK條件下，轉(zhuǎn)基因株系比受體

8、提高了分蘗數(shù)，差異達(dá)到顯著水平。在不同施肥處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系的單株穗粒數(shù)都有較大提升，與受體相比差異都達(dá)到了極顯著水平。在大部分施肥處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因植株的畝產(chǎn)都比受體要高，多數(shù)差異達(dá)到極顯著水平。轉(zhuǎn)基因小麥材料的千粒重與受體鄭147差異不大。轉(zhuǎn)基因株系和受體的單株主莖小穗數(shù)差異不大，卻明顯比受體的不育小穗數(shù)少，這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因提升了植株的小穗可育性，在千粒重和單株穗數(shù)提升不明顯的情況下使轉(zhuǎn)基因植株單株穗粒數(shù)提升，是最終產(chǎn)量提升的