調(diào)控大豆抗逆反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子基因的分離與功能鑒定.pdf

1、非生物脅迫對植物的生理代謝產(chǎn)生各種各樣的影響，植物通過改變自身基因的表達(dá)而改變其體內(nèi)的代謝機制，從而對各種非生物環(huán)境脅迫進(jìn)行耐受和適應(yīng)。植物體內(nèi)基因表達(dá)的變化受到多種的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的調(diào)控，作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)重要組成部分的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控脅迫相關(guān)的基因表達(dá)的過程中發(fā)揮著重要的作用。其中AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子是近年來研究較多，也最詳盡的一個轉(zhuǎn)錄因子家族；作為其亞家族，DREB類轉(zhuǎn)錄因子也成為植物分子生物學(xué)和植物抗旱分子機理研究的重要對象。

2、 本論文研究中，根據(jù)DREB類蛋白的AP2/EREBP保守域的氨基酸序列設(shè)計探針，通過菌斑原位雜交技術(shù)獲得兩個新的mRNA的全長序列。利用特異性的引物，經(jīng)RT-PCR獲得了2個cDNA的開放閱讀框序列，其核苷酸長度分別為477bp和816bp，命名為GmDREB2和GmDREB3，GmDREB2和GmDREB3分別編碼含有159和272個氨基酸的蛋白。經(jīng)氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)分析，GmDREB2和GmDREB3蛋白與在擬南芥中有過詳細(xì)

3、報道的EREBP/AP2家族轉(zhuǎn)錄因子具有高度的同源性，其蛋白結(jié)構(gòu)類似于已經(jīng)從擬南芥中分離的DREB轉(zhuǎn)錄因子，推測GmDREB2和GmDREB3蛋白屬于DREB亞家族，在調(diào)控抗逆基因表達(dá)的過程中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。 GmDREB2和GmDREB3能夠在大腸桿菌中以GST融合蛋白的形式表達(dá)，DNA片段具有較好的表達(dá)活性；純化融合蛋白GST-GmDREB2和GST-GmDREB3，通過凝膠阻滯技術(shù)研究了GmDREB2和GmDREB3融

4、合蛋白與野生型或突變型DRE元件特異性的結(jié)合。研究結(jié)果表明，GmDREB2和GmDREB3蛋白與野生型DRE元件核心序列特異性結(jié)合，與突變型DRE元件核心序列特異性相互作用弱，其影響顯著大于DRE元件兩端堿基。通過酵母單雜交技術(shù)研究了GmDREB2和GmDREB3在酵母中的轉(zhuǎn)錄激活作用，GmDREB2和GmDREB3激活了DRE元件調(diào)控下的HIS3報告基因的高效表達(dá)，使得酵母在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD/-HIS+3AT能夠生長，證明了GmD